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Pandemia, Virus

pruebas PCR activadas por luz

pruebas PCR

En el último año ha habido muchos desarrollos y noticias en torno a las pruebas PCR, estos días ha surgido un nuevo enfoque por parte de químicos de la LMU que podría ayudar a mejorar significativamente las pruebas de diagnóstico basadas en la PCR. Las enzimas utilizadas se activan mediante pulsos de luz.

Las ADN polimerasas y otras enzimas modificadoras del ADN son herramientas esenciales en biotecnología y diagnóstico. Son el componente clave para el diagnóstico por PCR de COVID-19. Por muy útiles que sean, las enzimas que procesan el ADN suelen tener defectos importantes. Algunas de ellas muestran una actividad significativa durante la preparación de la muestra, mientras que otras tienen actividades secundarias desagradables. Ambas pueden conducir a la pérdida de especificidad y sensibilidad, lo que debe evitarse en una prueba de diagnóstico.

El truco consiste en bloquear cualquier tipo de actividad enzimática hasta que se inicie el ensayo. En el caso de las pruebas de diagnóstico basadas en la PCR, como la mencionada prueba COVID-19, la solución es el desarrollo de una enzima de arranque en caliente, que no muestra actividad hasta que se alcanza una temperatura de activación elevada. El principal inconveniente de estos métodos de arranque en caliente es que no pueden utilizarse para enzimas dañadas por el calor, afirma el bioquímico de la LMU Andrés Vera. “Además, el trazado de una enzima de arranque en caliente es tedioso y hay que repetir el laborioso método de trazado para cada nueva enzima que necesitemos trazar”.

Junto con Merve-Zeynep Kesici, del grupo del profesor Philip Tinnefeld en el Departamento de Química de la LMU, Andrés encontró una forma de evitar estos problemas diseñando enzimas de arranque en caliente. Sus enzimas de arranque en caliente se bloquean hasta que un pulso de luz ultravioleta las reactiva. “Las enzimas controladas por la luz existen desde hace mucho tiempo, pero lo que hace que nuestro enfoque sea único es que puede aplicarse a prácticamente cualquier enzima de procesamiento de ADN. En el pasado, siempre se necesitaba información muy detallada sobre el funcionamiento de la enzima, y además no se sabía si se podía proporcionar una forma inteligente de represar la enzima y reactivarla con luz”, dice Vera, el líder del emprendimiento.

En su enfoque, los investigadores adjuntaron un trozo de ADN a la propia enzima, que compite en exceso con cualquier otro sustrato de la enzima, lo que la deja inactiva (incluidas sus actividades secundarias).

El pulso de luz se utiliza para cortar el ADN unido a la enzima, dando como resultado una enzima 100% activa. La principal ventaja es que el mecanismo debería funcionar para una amplia gama de enzimas de unión al ADN, independientemente de su modo de acción específico.

Para demostrarlo, los investigadores produjeron cuatro versiones activables por luz de diferentes enzimas de procesamiento de ADN. Entre ellas se encontraba la llamada ADN polimerasa Phi29, una enzima muy utilizada para amplificar genomas completos, pero demasiado sensible al calor para ser adecuada para los métodos de arranque en caliente. Además, el equipo demostró la PCR de arranque ligero y demostró que sus ADN polimerasas eran tan buenas o mejores en comparación con las enzimas comerciales de PCR de arranque en caliente.

Philip Tinnefeld se congratula de este nuevo avance: “Esto ayudará sin duda a producir mejores enzimas para uso biotecnológico y de diagnóstico. Además, las máquinas de PCR en tiempo real existentes ya incorporan fuentes de luz y podrían modificarse fácilmente para introducir estas enzimas en el mercado en cualquier momento.

PCR protocolo o PCR protocol

pcr protocol

Introducción

En este articulo se hablarán en profundidad del PCR protocolo o PCR protocol para dar claridad a este tema.

Una vez que tiene sus muestras genéticas, uno de los primeros pasos de la PCR es diseñar los cebadores necesarios para realizar la reacción de PCR.

El primer paso para proceder a una PCR estándar es el diseño de los cebadores. Deberá determinar qué fragmento de la plantilla de ADN desea amplificar, para lo cual deberá conocer la secuencia de ADN de la plantilla. La base de datos del NCBI, un servidor web con todas las secuencias de ADN conocidas, es un buen recurso que puede utilizar para buscar su secuencia. A continuación, deberá diseñar dos cebadores, el directo y el inverso. El diseño de los cebadores es un paso crítico en un protocolo de PCR. El conjunto de cebadores debe flanquear el fragmento que pretende amplificar a partir de la plantilla de ADN. El cebador directo se unirá a la cadena de ADN 3′-5′ y el cebador inverso se unirá a la cadena de ADN 5′-3′. Consulte el siguiente diagrama.

Cebador delantero o cebador inverso

Muchos de los problemas del PCR protocolo o PCR protocol están asociados a un diseño incorrecto de los cebadores. Los errores más comunes en el diseño incluyen

  • Dímeros de cebadores
  • Estructuras de bucle de horquilla por auto recocido del cebador
  • Recocido no específico

La longitud del cebador debe ser de unos 18-30 pb, el contenido de GC cercano al 50% y la temperatura de fusión (TM) entre 55ºC y 65ºC. Para calcular la temperatura de fusión, se puede utilizar la siguiente ecuación Tm = 2°C(A+T) + 4°C(G+C). Aunque la mayoría de las polimerasas de ADN comerciales proporcionan su propia calculadora e instrucciones específicas para diferentes condiciones, existen varias plataformas web de ayuda al diseño de cebadores.

Una vez que hayas obtenido tus muestras de ADN y hayas diseñado tus cebadores directos e inversos, puedes proceder con el experimento de PCR.

PCR protocolo o PCR protocol

Protocolo general de PCR - GENERAL PCR Protocol

Reactivos

  • Cebadores directos e inversos
  • dNTPs
  • Plantilla de ADN
  • ADN polimerasa

Nota: Desde el comienzo de tu experimento de PCR hasta el final, debes usar siempre guantes para evitar la contaminación del ADN. Todos los reactivos, cebadores y enzimas deben mantenerse en hielo. Asegúrate de que los cebadores, la plantilla de ADN y el tampón están completamente descongelados antes de empezar a preparar la solución de PCR.

Es importante crear un diseño experimental de acuerdo con las directrices científicas, incluyendo un control positivo y un control negativo. Como control negativo, puede preparar una PCR privada de plantilla de ADN. Para el control positivo, debe utilizar un conjunto de cebadores y plantilla de ADN que haya demostrado funcionar correctamente en experimentos anteriores

Dependiendo de la ADN polimerasa que utilice, la concentración final de cada reactivo variará. Estos son los volúmenes y concentraciones estándar teniendo en cuenta una reacción de 50ul:

  1. En tubos de PCR de 200 μl:
  • Añadir 38 μl de agua estéril.
  • Añadir 2 μl de cebador directo (10 μM).
  • Añadir 2 μl de cebador inverso (10 μM).
  • Añadir 1 μl de dNTPs (50 μM).
  • Añadir 5 μl de tampón de reacción con MgCl2 (10X).
  • Añadir 1 μl de molde de ADN (100 ng/μl).
  • Añadir 1 μl de ADN polimerasa (0,5 U/μl).

Nota: Si está dispuesto a realizar un número importante de reacciones de PCR, se recomienda preparar una mezcla de reacción, excluyendo los reactivos que serán diferentes de un experimento a otro (normalmente el molde de ADN o el conjunto de cebadores).

  1. Pipetear suavemente la mezcla de reacción para permitir una buena homogeneización.
  2. Se recomienda un giro corto en una centrífuga.
  3. Asegúrese de que los tapones de los tubos de PCR estén cerrados.
  4. Introduzca el tubo en el termociclador.
MB pcr cycle pcr protocol

Nota: Preste siempre atención a las directrices de la ADN polimerasa, ya que la temperatura y el tiempo de desnaturalización, recocido y extensión dependen en gran medida de ella. En el termociclador, deberá configurar estos pasos posteriormente (consulte el diagrama anterior):

  1. Un paso inicial de desnaturalización del ADN a 94°C a 98°C durante 3 a 5 minutos, dependiendo de la temperatura óptima de la ADN polimerasa
  2. Temperatura de desnaturalización (la misma utilizada en el paso anterior) durante 30 segundos
  3. Temperatura de recocido teniendo en cuenta la Tm de los cebadores durante 30 segundos
  4. Temperatura de extensión a 72°C y teniendo en cuenta el tamaño del fragmento a amplificar

Estos pasos deben repetirse durante 25 a 35 rondas (ciclos). Se requiere un último paso de extensión para permitir que todos los productos de la PCR se sinteticen correctamente, normalmente a 72°C durante 10 min. Por último, la temperatura debe reducirse a 4°C para almacenar el producto de la PCR.

Análisis PCR: Electroforesis en gel

  1. Cargar la mezcla de 6 μl en un gel de agarosa al 1%.
  2. Cargar 5 μl de marcador de ADN en el mismo gel.
  3. Utilice un transiluminador UV para visualizar el producto de la PCR en el gel de agarosa.

Nota: Para evitar la tinción con bromuro de etidio, puede utilizar geles preteñidos Midori o Red Safe, que son compuestos menos tóxicos. Utilice un marcador de ADN para comparar el tamaño correcto del producto de la PCR.

Protocolo de transcripción inversa

La transcripción inversa es el proceso por el cual el ARN se transcribe a ADN, lo que nos permitirá realizar experimentos como la qRT-PCR bajo la actividad catalítica de una ADN polimerasa específica que sólo es capaz de amplificar fragmentos de moléculas de ADN.

Nota: Desde el inicio de tu experimento de PCR hasta el final, debes usar siempre guantes para evitar la contaminación del ADN. Todos los reactivos, cebadores y enzimas deben mantenerse en hielo.

  1. En un tubo de PCR de 200 μl:
    a. Añade 2 μg de ARN total.
    b. Añada 1 ul de oligo dt (50μM).
    c. Añadir 1 μl de dNTP (10mM).
    d. Añadir agua tratada con DEPC hasta 10 μl.
  2. Incubar a 65 °C durante 5 min y luego mantener los tubos en hielo durante 1 min.
  3. Añadir 2 ul de tampón RT (10X) .
  4. Añadir 4 μl de MgCl2.
  5. Añadir 2 μl de DTT (0,1 M).
  6. Añadir 1 ul de inhibidor de RNasa (40 U/μl).
  7. Añadir 1 ul de transcriptasa inversa (200 U/μl).
  8. Incubar a 50°C durante 60 min, seguido de 85°C durante 5 min.
  9. Después, mantener el tubo en hielo.
  10. Añadir 1 μl de RNasa H.
  11. Incubar durante 30 min a 37°C.
  12. Guarde el tubo de PCR a -20°C.
  13. Para la cuantificación y calidad del ARN, utilice un equipo NanoDrop para medir las concentraciones de ARN (260 nm), proteínas y sales.

qRT-PCR PROTOCOL

De forma similar a la PCR estándar, debe diseñarse un conjunto de cebadores como se ha descrito anteriormente para amplificar cada fragmento de ADNc de interés, que suele corresponder a un gen específico. Además, también se recomienda diseñar cebadores específicos para otros genes de ADNc para los procedimientos de normalización de datos, que también se conocen como genes “de mantenimiento” (por ejemplo, 18S, GAPDH, ACTB).

Para cada gen de ADNc, prepare la siguiente mezcla de reacción en tubos de PCR de 200 μl para un volumen final de 50 μl:

  • Añadir 25 μl de SYBR Green Mix (2x).
  • Añada 1 μl de ADNc de la muestra de ADNc anterior.
  • Añadir 1 μl de Forward Primer (10 mM).
  • Añadir 1 μl de Reverse Primer (10 mM).
  • Añadir 22,5 μl de agua DEPC.
  • Introduzca los tubos en el termociclador.

Una vez finalizada la PCR, realizar el análisis de cuantificación por el método Ct comparativo. El método Ct compara los valores Ct de las muestras con las muestras estándar. Los valores Ct de los controles y de las muestras se normalizan utilizando los valores Ct obtenidos para los genes housekeeping. Para validar el cálculo del Ct, se requiere que las eficiencias de amplificación de la diana sean cercanas a las endógenas. Esto se puede conseguir mediante la utilización de diferentes diluciones de la plantilla.

Mouse IFN-beta ELISA

Las características del “Mouse IFN-beta ELISA”

Los emparejamientos optimizados de anticuerpos de captura y detección con las concentraciones recomendadas ahorran mucho tiempo de desarrollo
Se proporcionan protocolos de desarrollo para guiar la optimización del ensayo
El ensayo puede adaptarse a sus necesidades específicas
Alternativa económica a los kits completos

SOCS-1 Antibody

SOCS1 es un miembro de la familia de los inhibidores de STAT (SSI), también conocidos como supresores de la señalización de citoquinas (SOCS). Los miembros de la familia SSI son reguladores negativos de la señalización de citoquinas. SOCS1 funciona a la salida de los receptores de citoquinas y participa en un bucle de retroalimentación negativa para atenuar la señalización de las citoquinas.

Los anticuerpos policlonales se producen inmunizando a los animales con un péptido sintético correspondiente a los residuos que rodean a Ala156 de SOCS1 humana. Los anticuerpos se purificaron mediante cromatografía de afinidad de proteínas A y péptidos.

Anti-SLC1A5 Antibody

Varios proveedores ofrecen antibodies anti-SLC1A5. Este gen codifica la proteína “solute carrier family 1 member 5” en humanos y también puede ser conocido como ASCT2, AAAT, ATBO, M7V1, neutral amino acid transporter B(0), y ATB(0). Estructuralmente, la proteína tiene una masa de 56,6 kilodaltons. Basándose en el nombre del gen, también se pueden encontrar ortólogos caninos, porcinos, de mono, de ratón y de rata.

Referencias

Moderna La Historia de la Compañia

moderna vacuna

Historia de la Compañia Moderna Inc (mRNA)

Introducción

Moderna, Inc es una empresa estadounidense de biotecnología y farmacéutica con sede en Cambridge, Massachusetts. Se centra en tecnologías de vacunas basadas en ARN mensajero (ARNm).

La plataforma de vacunas de Moderna inserta ARN mensajero sintético modificado con nucleósidos (modARN) en células humanas utilizando una capa de nanopartículas lipídicas.

Este ARNm luego reprograma las células para provocar respuestas inmunes.

Moderna desarrolla vacunas terapéuticas de ARNm que se administran en nanopartículas lipídicas, utilizando ARNm con nucleósidos de Pseudouridina.

Los candidatos están diseñados para tener una eficacia mejorada de plegado y traducción mediante mutagénesis de inserción.

¿Qué es mRNA?

El ARN mensajero, o ARNm, juega un papel fundamental en la biología humana, transfiriendo las instrucciones almacenadas en el ADN para producir las proteínas necesarias en cada célula viva.

Nuestro enfoque es utilizar medicamentos de ARNm para instruir a las propias células del paciente para que produzcan proteínas que podrían prevenir, tratar o curar enfermedades.

Historia de la compañia

2010–2016

En 2010, se formó “ModeRNA Therapeutics” para comercializar la investigación del biólogo de células madre Derrick Rossi.

Rossi había descubierto los trabajos de la bioquímica húngara Katalin Karikó sobre la activación inmune mediada por ARN, lo que resultó en el descubrimiento conjunto con el inmunólogo estadounidense Drew Weissman de las modificaciones de nucleósidos que suprimen la inmunogenicidad del ARN.

Esta tecnología luego sería autorizada y utilizada por Moderna y BioNTech para desarrollar vacunas COVID-19.

En 2011, Noubar Afeyan, el mayor accionista de Moderna, contrató a Stéphane Bancel, anteriormente ejecutivo de BioMérieux y Eli Lilly and Company, como CEO.

A los 2 años de su fundación, la empresa alcanzó una valoración de unicornio.

En marzo de 2013, Moderna y AstraZeneca firmaron un acuerdo de opción exclusiva de cinco años para descubrir, desarrollar y comercializar ARNm para tratamientos en las áreas terapéuticas de enfermedades cardiovasculares, metabólicas y renales, y objetivos seleccionados para el cáncer.

El acuerdo incluía un pago por adelantado de 240 millones de dólares a Moderna, un pago que fue “uno de los pagos iniciales más grandes en un acuerdo de licencia de la industria farmacéutica que no involucra un medicamento que ya se está probando en ensayos clínicos”.

En septiembre de 2013, la compañía informó que pudo mejorar la función cardíaca en ratones y mejorar su supervivencia a largo plazo con una “redirección de su diferenciación [de células madre] hacia tipos de células cardiovasculares” en un paso significativo para la medicina regenerativa.

En octubre de 2013, DARPA otorgó a la compañía hasta $ 25 millones para desarrollar terapias de ARN mensajero. En noviembre de 2013, la empresa recaudó 110 millones de dólares de financiación de capital.

En enero de 2014, Alexion Pharmaceuticals pagó a Moderna $ 100 millones por diez opciones de productos para desarrollar tratamientos de enfermedades raras, incluido el síndrome de Crigler-Najjar, utilizando la plataforma terapéutica de ARNm de Moderna.

Aunque el CEO Bancel esperaba que la plataforma ingresara a ensayos en humanos en 2016, el programa con Alexion se descartó en enero de 2017 después de que los ensayos en animales mostraran que el tratamiento de Moderna nunca sería lo suficientemente seguro para los humanos.

2017

En noviembre de 2017, Maja Sedic y sus colegas probaron la tecnología de ARNm en ratas Sprague-Dawley y monos cynomolgus en las instalaciones de Montreal y Sherbrooke de Charles River Laboratories.

Descubrieron, entre otras cosas, que “el ARNm es una molécula biológica lábil y, por lo tanto, requiere el uso de sistemas protectores de administración para aprovechar eficazmente su potencial”, ya que el ARNm se propaga más allá del sitio de inyección y se encuentra en el hígado, el bazo, la médula ósea y corazón.

2018–2020

En 2018, la compañía cambió su nombre a “Moderna Inc.” y aumentó aún más su cartera de desarrollo de vacunas.

En julio de 2018, la compañía abrió una instalación de 200,000 pies cuadrados en Norwood, Massachusetts para trabajos de manufactura, preclínicos y clínicos.

En diciembre de 2018, Moderna se convirtió en una empresa pública a través de la oferta pública inicial de biotecnología más grande de la historia, recaudando $ 621 millones (27 millones de acciones a $ 23 por acción).

5 Cosas que debes saber sobre Moderna

La ciencia detrás del oleoducto

Lo primero que debes saber sobre moderna es que Moderna es llamada “ARNm” “el software de la vida”.

Las células usan el ARNm para traducir el ADN en las proteínas que el cuerpo usa para funcionar. Moderna cree que puede usar ARNm para estimular al cuerpo a producir sus propias proteínas terapéuticas, esencialmente colocando una fábrica de medicamentos dentro del paciente.

Como se puede suponer, no es una tarea fácil. Los científicos de Moderna tienen un gran trabajo por delante: para cada fármaco potencial, necesitan descubrir cómo llevar la terapia de ARNm de manera segura a las células adecuadas, asegurarse de que el ARNm realmente produzca cantidades suficientes de proteína para tener un efecto terapéutico y garantizar la las terapias no desencadenarán una reacción inmunitaria en los pacientes.

Años lejos de un producto comercializable

Los programas de desarrollo de fármacos de la empresa abarcan una amplia gama de especialidades clínicas, que abarcan enfermedades infecciosas, oncología, enfermedades cardiovasculares y enfermedades genéticas raras.

El unicornio biotecnológico tiene 21 medicamentos basados ​​en ARNm en desarrollo, pero solo 10 están en ensayos clínicos.

Cómo señaló la compañía en su presentación de valores más reciente, la FDA ni ninguna otra agencia reguladora ha aprobado ningún medicamento basado en ARNm, por lo que pasarán años antes de que Moderna pueda comercializar algo.

Los ejecutivos hacen un bonito centavo

Moderna reveló la compensación de sus tres ejecutivos mejor pagados, quienes ganaron $ 40 millones en efectivo y acciones en 2017.

Stephen Hoge, el presidente de la compañía, recibió $ 19 millones en opciones y un bono en efectivo de $ 4.4 millones en 2017.

Lorence Kim, el director financiero de Moderna recibió $ 5,5 millones en acciones y un bono en efectivo de $ 1 millón, mientras que el director ejecutivo Stéphane Bancel recibió $ 4,6 millones en opciones y un bono en efectivo de $ 1,5 millones.

La FDA tiene un problema con uno de sus productos.

A principios de este año, Moderna se topó con un bache de velocidad mientras trabajaba en la combinación de dos vacunas para el citomegalovirus, o CMV, según las presentaciones de valores de la compañía.

Moderna estaba realizando una prueba en una etapa inicial cuando se dio cuenta en agosto de que una de las vacunas “no cumplía con nuestras especificaciones de control de calidad interno para la inspección visual después de un año de almacenamiento”.

La FDA suspendió clínicamente el ensayo y Moderna acordó eliminar esa vacuna del estudio.

La quema de efectivo es alta

Moderna gastó casi $ 360 millones en gastos operativos en los primeros nueve meses de 2018, y la compañía advirtió a los inversionistas en su última presentación de valores que el gasto en efectivo probablemente aumentaría a medida que continúa desarrollando sus programas clínicos.

“Hemos incurrido en pérdidas significativas desde nuestros inicios y anticipamos que continuaremos incurriendo en pérdidas significativas en el futuro previsible”, escribió la compañía.

Reacción en cadena de la polimerasa (ASO-PCR)

Reacción en cadena de la polimerasa

ASO-PCR (método alternativo para la detección de mutaciones)

Introducción

La reacción en cadena de la polimerasa con oligonucleótidos específicos de alelo (ASO-PCR) es un método alternativo para la detección de mutaciones.

La ventaja de ASO PCR es que es un método rápido, simple y no radiactivo.

Se están descubriendo cada vez más muchas sustituciones de un par de bases que conducen a enfermedades hereditarias, predisposición a trastornos genéticos y cáncer.

La capacidad de amplificar secuencias de ADN específicas mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha hecho posible diagnosticar con rapidez y precisión muchas enfermedades hereditarias.

Antes del uso de PCR, las mutaciones puntuales se identificaron usando clonación y secuenciación directa.

También la transferencia de Southern e hibridación con sondas de oligonucleótidos marcadas centradas en el sitio de la mutación o digestión con endonucleasas de restricción.

Estos métodos se han mejorado en gran medida mediante la PCR, que permite la amplificación de fragmentos de ADN que contienen los sitios polimórficos a partir de cantidades diminutas de ADN.

Sin embargo, estas técnicas tienden a consumir mucho tiempo, son complejas, requieren el uso de un marcador radiactivo y, en el caso de la detección de endonucleasas de restricción, solo son aplicables cuando la mutación altera un sitio de escisión conocido.

¿Qué es un ASO?

Un oligonucleótido específico de alelo (ASO) es una pieza corta de material sintético ADN , complementaria a la secuencia de un ADN diana variable.

Actúa como Investigación para la presencia del objetivo en un Mancha sureña ensayo o, más comúnmente, en el más simple Mancha de puntos ensayo. Es una herramienta común utilizada en Prueba genética, forense, y Biología Molecular investigación.

Un ASO es típicamente un oligonucleótido de 15-21 bases de nucleótidos en longitud. Está diseñado (y utilizado) de una manera que lo hace específico para una sola versión, o alelo, del ADN que se está probando.

La longitud del ASO, de qué hebra se elige y las condiciones por las que se obligado a (y lavado de) el ADN diana, todos juegan un papel en su especificidad.

Estas sondas generalmente se pueden diseñar para detectar una diferencia de tan solo 1 base en la secuencia genética de la diana, una capacidad básica en el ensayo de polimorfismos de un sólo nucleótido (SNP), importante en análisis de genotipo y el Proyecto Genoma Humano.

Para ser detectado después de que se ha unido a su objetivo, el ASO debe estar marcado con una etiqueta radiactiva, enzimática o fluorescente.

La tecnología ASO aprovecha para detectar la diferencia de un par de bases (citosina versus timina) para medir la metilación en un sitio CpG específico.

¿Qué significa ASO-PCR?

La reacción en cadena de la polimerasa con oligonucleótidos específicos de alelo (ASO) es un método alternativo para la detección de mutaciones en el que solo el oligonucleótido perfectamente emparejado puede actuar como cebador para la amplificación. La ventaja de ASO PCR es que es un método rápido, simple y no radiactivo.

La ASO-PCR, también conocida como sistema de mutación refractaria a la amplificación (ARMS) se describió por primera vez para la detección de mutaciones en el gen de la α1-antitripsina.

Desde entonces se ha adoptado en el estudio de varios genes, incluido el diagnóstico prenatal de fibrosis quística, polimorfismos de la apolipoproteína E y mutaciones puntuales en el oncogén ras.

En esta técnica, los cebadores de oligonucleótidos se diseñan de manera que sean complementarios a la secuencia normal (tipo salvaje) o mutante, y ambos se utilizan junto con un cebador común.

Debido a que la ADN polimerasa carece de actividad exonucleasa 3 ‘, es incapaz de reparar un desajuste de una sola base entre el cebador y el molde en el extremo 3’ de los cebadores de ADN.

Por tanto, si los cebadores de oligonucleótidos se diseñan para contener desapareamientos cerca o en el extremo 3 ‘, el cebador se extenderá o no dependiendo de qué polimorfismos de base única alternativos estén presentes en la secuencia diana.

Por tanto, en las condiciones rigurosas apropiadas, sólo se amplificará el ADN diana exactamente complementario al cebador.

A continuación se muestra un protocolo simple para la PCR de nucleótidos específicos de alelo.

¿Cómo funciona?

La reacción en cadena de la polimerasa específica de alelo (ASPCR) es una aplicación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que permite la detección directa de cualquier mutación puntual en el ADN humano mediante el análisis de los productos de la PCR en un gel de agarosa o poliacrilamida teñido con bromuro de etidio.

Pionero

Fue pionero en el uso de oligonucleótidos sintéticos como sondas específicas para las variaciones de la secuencia genética por R. Bruce Wallace, trabajando en la Centro médico de la ciudad de la esperanza nacional en Duarte, California.

En 1979, Wallace y sus compañeros de trabajo informaron el uso de sondas ASO para detectar variaciones en un sola hebra virus bacteriano, y posteriormente aplicó la técnica de clonado genes humanos.

En 1983 y 1985 Laboratorio de Wallace informó la detección de la mutación para anemia de células falciformes en las muestras de la “DNA genomic entera”, aunque esta aplicación fue obstaculizada por la poca cantidad de etiquetas que podrían ser llevadas por la ASO.

Afortunadamente también se informó de PCR, un método para amplificar grandemente un segmento específico de ADN, en 1985.

En menos de un año había sido emparejado PCR Análisis de ASO. Esta combinación solucionó el problema del etiquetado de ASO, puesto que la cantidad de ADN diana podría ampliarse sobre un pre-existente.

También, la especificidad del propio proceso PCR podría añadirse a la de las sondas ASO, lo que reduce el problema de Unión espuria de la ASO a secuencias diana no.

La combinación era bastante específica que podría ser utilizado de una forma sencilla Blot dot, evitando el laborioso e ineficiente Mancha blanca /negra meridional método.

PCR basada en test de Oligonucleótidos Específicos de Alelo (ASO)

La nueva secuenciación del ADN de una serie de peces, identifica : un polimorfismo de nucleótido único (SNP) correspondiente a dos alelos (A y B) de un solo gen (superior, medio).

Se construyen dos cebadores de PCR que son específicos para los alelos A y B de SNP, respectivamente.

Estos oligonucleótidos específicos de alelo (ASO) se emparejan con un cebador de anclaje para una secuencia de ADN común a todos los peces (arriba, derecha).

El progreso de la PCR se controla en “tiempo real” y una reacción exitosa indica la presencia del alelo SNP correspondiente.

aso-pcr

Aplicación a la acuicultura

Un acuicultor desea saber si algunos de los peces (machos) utilizados en un experimento de desove masivo, contribuyen de manera desproporcionada al acervo genético de la próxima generación.

Ella selecciona dos machos que son homocigotos para los SNP A y B, respectivamente, y una hembra sin marcar (arriba, izquierda).

Los tres peces pueden desovar al azar; Se seleccionan 48 larvas (abajo a la izquierda).

Las pruebas A y B ASO se ejecutan simultáneamente en todas las larvas en un formato de placa de 96 pocillos, en filas alternas (abajo, derecha).

Aquí, solo 8 de las 48 larvas tienen el alelo B, lo que indica una ventaja reproductiva de cinco veces del padre A.

Aplicación a la biodiversidad

Un administrador de pesquerías desea conocer la abundancia relevante de huevos de peces ,de dos especies, diferentes con tamaño similar que se encuentran en el plancton.

Ella identifica una región en la que las dos especies se diferencian por un único SNP, produciendo los alelos A y B, respectivamente (arriba, izquierda).

Se construyen los ASO específicos de A y B (arriba a la derecha).

El ADN se extrae de cada uno de los 48 huevos (abajo a la izquierda), y las pruebas A y B ASO se ejecutan en cada huevo simultáneamente en un formato de placa de 96 pocillos, en filas alternas (abajo, derecha).

Aquí, solo 8 de las 48 larvas tienen el alelo B, lo que indica una abundancia de cinco veces la especie A en relación con la especie B.

Este método “RT-PCR ASO” es una alternativa al requisito tradicional de los ensayos electroforéticos, y hace posible el cribado rápido y a gran escala de poblaciones y cohortes de larvas.

Referencias
  1. Studencki AB, Conner BJ, Impraim CC, Teplitz RL y Wallace RB “Discriminación entre los genes de la globina beta A, beta S y beta C humana utilizando sondas de hibridación de oligonucleótidos específicos de alelo“. Am J Hum Genet vol. 37 (1), págs. 42-51 (1985).
  2. B Saiki, RK; Scharf S; Faloona F; Mullis KB; Horn GT; Erlich HA; Arnheim N (20 de diciembre de 1985). “Reacción en cadena de la polimerasa y diagnóstico molecular“.
  3. Wallace, RB; Shaffer, J; Murphy, RF; Bonner, J; Hirose, T; Itakura, K (1979). “Hibridación de oligodesoxirribonucleótidos sintéticos con ADN Phi-X 174: el efecto del desajuste de un solo par de bases“.
  4. Conner BJ, Reyes AA, Morin C, Itakura K, Teplitz RL y Wallace RB “Detección del alelo de la beta S-globina de células falciformes por hibridación con oligonucleótidos sintéticos”. Proc Natl Acad Sci USA. vol. 80 (1), págs. 278-282 (1983).
  5. Saiki RK, Bugawan TL, Horn GT, Mullis KB y Erlich HE “Análisis de ADN de beta-globina y HLA-DQ amplificado enzimáticamente con sondas de oligonucleótidos específicos de alelo”
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Las pruebas genéticas: métodos y beneficios.

Las pruebas genéticas: métodos y beneficios.

Las pruebas genéticas son un tipo de reconocimiento médico que identifica cualquier cambio en los cromosomas, genes o proteínas. Al obtener los resultados de las pruebas, podemos confirmar o rechazar un presunto trastorno genético. De hecho, el análisis determina el riesgo de desarrollar o transmitir un trastorno genético.

Métodos de las pruebas genéticas

En primer lugar, hay varios métodos de pruebas genéticas. Los tipos de pruebas genéticas más comunes dependen del nivel de una anormalidad moderada. Por ejemplo, hay tres métodos que incluyen: pruebas bioquímicas, pruebas citogenéticas y pruebas moleculares. Estas pruebas detectan anomalías en la función de proteínas, la estructura de cromosomas y la secuencia del ADN.

Análisis citogenético

En segundo lugar, el análisis citogenético detecta irregularidades en los cromosomas. Para ejemplificar, el cromosoma de una célula humana está procesada en los glóbulos blancos, especialmente en el linfocito T. Luego, recogemos las células de la médula ósea, del líquido amniótico y de otros tejidos, y las utilizamos para el análisis citogenético. Después de varios días de cultivo celular, los cromosomas se establecen, se extienden en un portaobjetos de microscopio y se tiñen. Finalmente, analizamos los cromosomas individualmente y se detectan los que tienen anormalidades.

Las pruebas bioquímicas genéticas

En tercer lugar, las pruebas bioquímicas examinan la función de proteínas en lugar del gen. Es decir, conocemos la mayoría de las enfermedades genéticas como errores innatos del metabolismo que interrumpen una vía metabólica. Por lo tanto, la prueba mide la actividad de proteínas (enzimas), el nivel de metabolitos y el tamaño o cantidad de la proteína (proteína estructural). El análisis requiere un tejido con una proteína presente en la sangre, la orina, el líquido amniótico o el líquido cefalorraquídeo. Dado que las proteínas son más débiles que el ADN, suelen degradarse rápidamente.  Por consiguiente, debemos recoger la muestra y almacenarla correctamente.

El diagnóstico genético molecular

A continuación, la prueba molecular analiza secuencia del ADN incluso para pequeñas mutaciones de ADN. De hecho, es el método más eficaz que se basa en la proteína. Por otro lado, es imposible hacer una prueba bioquímica basándose en este método. Podemos hacer una prueba de ADN en cualquier tipo de muestra de tejido, lo que sólo requiere una pequeña cantidad de muestra. Además, podemos aplicar varias tecnologías moleculares diferentes para realizar la prueba. Eso incluye secuenciación directa, ensayos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) e hibridación.

Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT – PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica flexible y de bajo costo.  Específicamente, la RT – PCR añade otra dimensión al diagnóstico genético. De ahí que sea un simple ensayo enzimático que permite la amplificación de un segmento específico del ADN, la parte del ADN se amplifica en muchas más copias. Por lo tanto, podemos analizarlas usando métodos de laboratorio convencionales.

La PCR dio origen a la PCR en tiempo real para la detección y análisis de genes en tiempo real. Por lo tanto, utilizamos la técnica a través del genotipado cuantitativo, la variación genética, el diagnóstico precoz de la enfermedad o el análisis forense. Además, la tecnología detecta la PCR durante la reacción. Con la RT – PCR, es posible hacer un genotipo cuantitativo y detectar polimorfismos de un solo nucleótido. Estos incluyen la discriminación alélica y las variaciones genéticas en una pequeña muestra portadora de la mutación. Además, la tecnología es útil para la identificación de genes y se basa en los fluorocromos.  Además, el análisis de las curvas de fusión de los productos amplificados es crucial. En resumen, la técnica depende del uso correcto de los materiales de calibración y referencia.

MULTIPLEX KIT PCR MASTITIS PCR kit
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PCR-MPX218-96D
Bioingentech 100T
PCR-EZ D-PCR MASTER MIX
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BS294
Bio Basic 100RXN, 100prep
MULTIPLEX KIT PCR Babesia & Theileria PCR kit
MULTIPLEX KIT PCR Babesia & Theileria PCR kit
PCR-MPX401-48D
Bioingentech 50T

¿Por qué es esencial la RT PCR?

Para ilustrar, a través de la RT PCR, obtenemos información inferible de múltiples PCRs convencionales. Es posible controlar la intervención terapéutica y la respuesta individual a los fármacos, gracias a la amplificación de la RT PCR con otras técnicas moleculares. De hecho, el tiempo real permite la detección de la amplificación de la PCR durante las primeras fases de la reacción. De la misma manera, la medición de la reacción cinética en las primeras fases de la PCR proporciona una ventaja.

Actualmente, la RT PCR es una técnica esencial para detectar y cuantificar los perfiles de expresión de los genes deseados. Las tecnologías de PCR que utilizamos para detectar los cebadores específicos de las especies son cruciales en la investigación. Además, proporcionan información complementaria sobre la biología de las interacciones planta-microbio. Es más fácil comprender cómo el genoma crea diferentes tipos de células y su contribución a las funciones celulares especializadas y, también, su contribución a la forma en que las células interactúan con el medio ambiente.

Sapovirus RT PCR kit
Sapovirus RT PCR kit
RTq-H630-100R
Bioingentech 100T
Entamoeba RT PCR kit
Entamoeba RT PCR kit
RTq-H683-50D
Bioingentech 50T
Mengovirus RT PCR kit
Mengovirus RT PCR kit
RTq-H453-150R
Bioingentech 150T

Beneficios del diagnóstico genético

Al final, las pruebas genéticas tienen beneficios potenciales, ya sea que los resultados sean negativos o positivos. Proporcionan un alivio de la incertidumbre; por lo tanto, las personas pueden tomar decisiones conscientes sobre su salud.

prueba-genetica-de-adn-prueba-genetica-metodos-y-beneficios-3d-ilustracion-prueba-genetica-en-tubo-de-ensayo

Referencias

Deepak, S., Kottapalli, K., Rakwal, R., Oros, G., Rangappa, K., Iwahashi, H., Masuo, Y., & Agrawal, G. (2007).  Real-Time PCR: Revolutionizing Detection and Expression Analysis of Genes. Current genomics8(4), 234–251.

https://doi.org/10.2174/138920207781386960

Genetic Alliance; District of Columbia Department of Health.  Understanding Genetics: A District of Columbia Guide for Patients and Health Professionals.  Washington (DC): Genetic Alliance; 2010 Feb 17.  Appendix C, Genetic Testing Methodologies.  Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK132150 /

NIH-U.S National Library of Medicine.  (2020). Genetic Testing.   https://ghr.nlm.nih.gov/primer/testing/genetictesting

Vídeo: https://www.youtube.com/watch?v=MjgfTUKiqm8

Epidemia, Pandemia, Virus

Alta demanda de puntas con filtro – Filter tips

Alta demanda de puntas con filtro - Filter tips

Debido al incremento en el uso de las pruebas PCR hay una escasez mundial de puntas con filtro PCR 1000 ul y 1250ul para la amplificación en pruebas de ADN.

Grandes distribuidores como Gentaur fabricaron puntas de filtro para poder continuar suministrando a los laboratorios de diagnóstico y forenses pero la producción de puntas con filtro grandes se ha detenido. Sin embargo, aún hay disponibles puntas de filtro pequeñas.

Evidentemente, esto no es suficiente ya que la demanda mundial de puntas ha aumentado demasiado rápido debido a la detección del coronavirus con PCR.

La prueba PCR, reacción en cadena de la polimerasa, es una técnica para amplificar el ADN usando una estación de trabajo Thermocycler y polimerasa TAQ (encima de la bacteria Thermus Aquaticus).

La PCR se utiliza en laboratorios forenses, laboratorios de diagnóstico y laboratorios de investigación. La detección de variaciones del cáncer, el virus del papiloma humano VPH y la resistencia a la tuberculosis con spolygotyping dependen de la PCR.

Gentaur suministraba originalmente puntas con filtro de Neptune scientific en San Diego, California, fabricadas en México. Nuestra importación se limita ahora a 10 cajas por mes pero necesitamos 500 cajas.

Sólo hay pequeñas plantas de puntas con filtro disponibles en el mundo. Bélgica y Polonia no fabrican por lo que nuestras puntas de filtro están producidas en Alemania en las empresas Greiner, Corning, …

De alta calidad caja de pipeta de puntas desechables 1000ul
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Filtro de punta de la pipeta 1000ul azul punta con filtro
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De alta calidad caja de pipeta de puntas desechables 10ul 20ul 50ul 100ul 200ul 1000ul 1250ul 5ml 10ml desechables
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Puntas con filtro

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AFG-FT-1250
AffiGEN 1250µL-768Tips
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Gentaur intentó obtener puntas con filtro en la India pero el gobierno indio prohibió en septiembre de 2020 la exportación este producto. El contenedor con puntas de filtro enviado a Europa fue retirado y regresó a Mumbai, Accumax, el fabricante indio.

Sin puntas de filtro disponibles en EE. UU., Europa e India, Gentaur ahora está intentando importar puntas de filtro en China pero los grandes laboratorios como Synlab priorizan los fabricantes chinos.

“Será un invierno difícil para nuestros clientes forenses, de diagnóstico y de investigación”, dice Lieven Gevaert, director de Gentaur Bvba en Kampenhout.

Nuestros clientes de laboratorio podrían cambiar y comenzar a trabajar con volúmenes más pequeños ya que todavía hay disponibles puntas con filtro de 10 ul. Si se agotan, técnicamente, estarán parados.

Desde los años 90 la PCR se ha vuelto cada vez más importante en nuestros laboratorios científicos. No puedo imaginar que este invierno podamos volver a una situación como la de antes de los 90, en la que ya no se pueda rastrear a los delincuentes, no se puede caracterizar el cáncer y no se detecten los virus.

Todavía existe la técnica de detección de antígenos y anticuerpos de SARS-CoV-2 pero carece de la misma velocidad de detección del virus SARS-CoV-2 tras la infección.

Las PCR pueden detectar el SARS-CoV-2 2 días después de que una persona entre en contacto con el virus COVID-19, el antígeno de 3 a 4 días y el anticuerpo de 5 a 7 días.

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