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Reacción en cadena de la polimerasa

Reacción en cadena de la polimerasa (ASO-PCR)

ASO-PCR (método alternativo para la detección de mutaciones)

Introducción

La reacción en cadena de la polimerasa con oligonucleótidos específicos de alelo (ASO-PCR) es un método alternativo para la detección de mutaciones.

La ventaja de ASO PCR es que es un método rápido, simple y no radiactivo.

Se están descubriendo cada vez más muchas sustituciones de un par de bases que conducen a enfermedades hereditarias, predisposición a trastornos genéticos y cáncer.

La capacidad de amplificar secuencias de ADN específicas mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha hecho posible diagnosticar con rapidez y precisión muchas enfermedades hereditarias.

Antes del uso de PCR, las mutaciones puntuales se identificaron usando clonación y secuenciación directa.

También la transferencia de Southern e hibridación con sondas de oligonucleótidos marcadas centradas en el sitio de la mutación o digestión con endonucleasas de restricción.

Estos métodos se han mejorado en gran medida mediante la PCR, que permite la amplificación de fragmentos de ADN que contienen los sitios polimórficos a partir de cantidades diminutas de ADN.

Sin embargo, estas técnicas tienden a consumir mucho tiempo, son complejas, requieren el uso de un marcador radiactivo y, en el caso de la detección de endonucleasas de restricción, solo son aplicables cuando la mutación altera un sitio de escisión conocido.

¿Qué es un ASO?

Un oligonucleótido específico de alelo (ASO) es una pieza corta de material sintético ADN , complementaria a la secuencia de un ADN diana variable.

Actúa como Investigación para la presencia del objetivo en un Mancha sureña ensayo o, más comúnmente, en el más simple Mancha de puntos ensayo. Es una herramienta común utilizada en Prueba genética, forense, y Biología Molecular investigación.

Un ASO es típicamente un oligonucleótido de 15-21 bases de nucleótidos en longitud. Está diseñado (y utilizado) de una manera que lo hace específico para una sola versión, o alelo, del ADN que se está probando.

La longitud del ASO, de qué hebra se elige y las condiciones por las que se obligado a (y lavado de) el ADN diana, todos juegan un papel en su especificidad.

Estas sondas generalmente se pueden diseñar para detectar una diferencia de tan solo 1 base en la secuencia genética de la diana, una capacidad básica en el ensayo de polimorfismos de un sólo nucleótido (SNP), importante en análisis de genotipo y el Proyecto Genoma Humano.

Para ser detectado después de que se ha unido a su objetivo, el ASO debe estar marcado con una etiqueta radiactiva, enzimática o fluorescente.

La tecnología ASO aprovecha para detectar la diferencia de un par de bases (citosina versus timina) para medir la metilación en un sitio CpG específico.

¿Qué significa ASO-PCR?

La reacción en cadena de la polimerasa con oligonucleótidos específicos de alelo (ASO) es un método alternativo para la detección de mutaciones en el que solo el oligonucleótido perfectamente emparejado puede actuar como cebador para la amplificación. La ventaja de ASO PCR es que es un método rápido, simple y no radiactivo.

La ASO-PCR, también conocida como sistema de mutación refractaria a la amplificación (ARMS) se describió por primera vez para la detección de mutaciones en el gen de la α1-antitripsina.

Desde entonces se ha adoptado en el estudio de varios genes, incluido el diagnóstico prenatal de fibrosis quística, polimorfismos de la apolipoproteína E y mutaciones puntuales en el oncogén ras.

En esta técnica, los cebadores de oligonucleótidos se diseñan de manera que sean complementarios a la secuencia normal (tipo salvaje) o mutante, y ambos se utilizan junto con un cebador común.

Debido a que la ADN polimerasa carece de actividad exonucleasa 3 ‘, es incapaz de reparar un desajuste de una sola base entre el cebador y el molde en el extremo 3’ de los cebadores de ADN.

Por tanto, si los cebadores de oligonucleótidos se diseñan para contener desapareamientos cerca o en el extremo 3 ‘, el cebador se extenderá o no dependiendo de qué polimorfismos de base única alternativos estén presentes en la secuencia diana.

Por tanto, en las condiciones rigurosas apropiadas, sólo se amplificará el ADN diana exactamente complementario al cebador.

A continuación se muestra un protocolo simple para la PCR de nucleótidos específicos de alelo.

¿Cómo funciona?

La reacción en cadena de la polimerasa específica de alelo (ASPCR) es una aplicación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que permite la detección directa de cualquier mutación puntual en el ADN humano mediante el análisis de los productos de la PCR en un gel de agarosa o poliacrilamida teñido con bromuro de etidio.

Pionero

Fue pionero en el uso de oligonucleótidos sintéticos como sondas específicas para las variaciones de la secuencia genética por R. Bruce Wallace, trabajando en la Centro médico de la ciudad de la esperanza nacional en Duarte, California.

En 1979, Wallace y sus compañeros de trabajo informaron el uso de sondas ASO para detectar variaciones en un sola hebra virus bacteriano, y posteriormente aplicó la técnica de clonado genes humanos.

En 1983 y 1985 Laboratorio de Wallace informó la detección de la mutación para anemia de células falciformes en las muestras de la “DNA genomic entera”, aunque esta aplicación fue obstaculizada por la poca cantidad de etiquetas que podrían ser llevadas por la ASO.

Afortunadamente también se informó de PCR, un método para amplificar grandemente un segmento específico de ADN, en 1985.

En menos de un año había sido emparejado PCR Análisis de ASO. Esta combinación solucionó el problema del etiquetado de ASO, puesto que la cantidad de ADN diana podría ampliarse sobre un pre-existente.

También, la especificidad del propio proceso PCR podría añadirse a la de las sondas ASO, lo que reduce el problema de Unión espuria de la ASO a secuencias diana no.

La combinación era bastante específica que podría ser utilizado de una forma sencilla Blot dot, evitando el laborioso e ineficiente Mancha blanca /negra meridional método.

PCR basada en test de Oligonucleótidos Específicos de Alelo (ASO)

La nueva secuenciación del ADN de una serie de peces, identifica : un polimorfismo de nucleótido único (SNP) correspondiente a dos alelos (A y B) de un solo gen (superior, medio).

Se construyen dos cebadores de PCR que son específicos para los alelos A y B de SNP, respectivamente.

Estos oligonucleótidos específicos de alelo (ASO) se emparejan con un cebador de anclaje para una secuencia de ADN común a todos los peces (arriba, derecha).

El progreso de la PCR se controla en “tiempo real” y una reacción exitosa indica la presencia del alelo SNP correspondiente.

aso-pcr

Aplicación a la acuicultura

Un acuicultor desea saber si algunos de los peces (machos) utilizados en un experimento de desove masivo, contribuyen de manera desproporcionada al acervo genético de la próxima generación.

Ella selecciona dos machos que son homocigotos para los SNP A y B, respectivamente, y una hembra sin marcar (arriba, izquierda).

Los tres peces pueden desovar al azar; Se seleccionan 48 larvas (abajo a la izquierda).

Las pruebas A y B ASO se ejecutan simultáneamente en todas las larvas en un formato de placa de 96 pocillos, en filas alternas (abajo, derecha).

Aquí, solo 8 de las 48 larvas tienen el alelo B, lo que indica una ventaja reproductiva de cinco veces del padre A.

Aplicación a la biodiversidad

Un administrador de pesquerías desea conocer la abundancia relevante de huevos de peces ,de dos especies, diferentes con tamaño similar que se encuentran en el plancton.

Ella identifica una región en la que las dos especies se diferencian por un único SNP, produciendo los alelos A y B, respectivamente (arriba, izquierda).

Se construyen los ASO específicos de A y B (arriba a la derecha).

El ADN se extrae de cada uno de los 48 huevos (abajo a la izquierda), y las pruebas A y B ASO se ejecutan en cada huevo simultáneamente en un formato de placa de 96 pocillos, en filas alternas (abajo, derecha).

Aquí, solo 8 de las 48 larvas tienen el alelo B, lo que indica una abundancia de cinco veces la especie A en relación con la especie B.

Este método “RT-PCR ASO” es una alternativa al requisito tradicional de los ensayos electroforéticos, y hace posible el cribado rápido y a gran escala de poblaciones y cohortes de larvas.

Referencias
  1. Studencki AB, Conner BJ, Impraim CC, Teplitz RL y Wallace RB “Discriminación entre los genes de la globina beta A, beta S y beta C humana utilizando sondas de hibridación de oligonucleótidos específicos de alelo“. Am J Hum Genet vol. 37 (1), págs. 42-51 (1985).
  2. B Saiki, RK; Scharf S; Faloona F; Mullis KB; Horn GT; Erlich HA; Arnheim N (20 de diciembre de 1985). “Reacción en cadena de la polimerasa y diagnóstico molecular“.
  3. Wallace, RB; Shaffer, J; Murphy, RF; Bonner, J; Hirose, T; Itakura, K (1979). “Hibridación de oligodesoxirribonucleótidos sintéticos con ADN Phi-X 174: el efecto del desajuste de un solo par de bases“.
  4. Conner BJ, Reyes AA, Morin C, Itakura K, Teplitz RL y Wallace RB “Detección del alelo de la beta S-globina de células falciformes por hibridación con oligonucleótidos sintéticos”. Proc Natl Acad Sci USA. vol. 80 (1), págs. 278-282 (1983).
  5. Saiki RK, Bugawan TL, Horn GT, Mullis KB y Erlich HE “Análisis de ADN de beta-globina y HLA-DQ amplificado enzimáticamente con sondas de oligonucleótidos específicos de alelo”
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