En este articulo se hablarán en profundidad del PCR protocolo o PCR protocol para dar claridad a este tema.

Una vez que tiene sus muestras genéticas, uno de los primeros pasos de la PCR es diseñar los cebadores necesarios para realizar la reacción de PCR.

El primer paso para proceder a una PCR estándar es el diseño de los cebadores. Deberá determinar qué fragmento de la plantilla de ADN desea amplificar, para lo cual deberá conocer la secuencia de ADN de la plantilla. La base de datos del NCBI, un servidor web con todas las secuencias de ADN conocidas, es un buen recurso que puede utilizar para buscar su secuencia. A continuación, deberá diseñar dos cebadores, el directo y el inverso. El diseño de los cebadores es un paso crítico en un protocolo de PCR. El conjunto de cebadores debe flanquear el fragmento que pretende amplificar a partir de la plantilla de ADN. El cebador directo se unirá a la cadena de ADN 3′-5′ y el cebador inverso se unirá a la cadena de ADN 5′-3′. Consulte el siguiente diagrama.

Muchos de los problemas del PCR protocolo o PCR protocol están asociados a un diseño incorrecto de los cebadores. Los errores más comunes en el diseño incluyen

• Dímeros de cebadores
• Estructuras de bucle de horquilla por auto recocido del cebador
• Recocido no específico

La longitud del cebador debe ser de unos 18-30 pb, el contenido de GC cercano al 50% y la temperatura de fusión (TM) entre 55ºC y 65ºC. Para calcular la temperatura de fusión, se puede utilizar la siguiente ecuación Tm = 2°C(A+T) + 4°C(G+C). Aunque la mayoría de las polimerasas de ADN comerciales proporcionan su propia calculadora e instrucciones específicas para diferentes condiciones, existen varias plataformas web de ayuda al diseño de cebadores.

Una vez que hayas obtenido tus muestras de ADN y hayas diseñado tus cebadores directos e inversos, puedes proceder con el experimento de PCR.

Reactivos

• Cebadores directos e inversos
• dNTPs
• Plantilla de ADN
• ADN polimerasa

Nota: Desde el comienzo de tu experimento de PCR hasta el final, debes usar siempre guantes para evitar la contaminación del ADN. Todos los reactivos, cebadores y enzimas deben mantenerse en hielo. Asegúrate de que los cebadores, la plantilla de ADN y el tampón están completamente descongelados antes de empezar a preparar la solución de PCR.

Es importante crear un diseño experimental de acuerdo con las directrices científicas, incluyendo un control positivo y un control negativo. Como control negativo, puede preparar una PCR privada de plantilla de ADN. Para el control positivo, debe utilizar un conjunto de cebadores y plantilla de ADN que haya demostrado funcionar correctamente en experimentos anteriores

Dependiendo de la ADN polimerasa que utilice, la concentración final de cada reactivo variará. Estos son los volúmenes y concentraciones estándar teniendo en cuenta una reacción de 50ul:

1. En tubos de PCR de 200 μl:

• Añadir 38 μl de agua estéril.
• Añadir 2 μl de cebador directo (10 μM).
• Añadir 2 μl de cebador inverso (10 μM).
• Añadir 1 μl de dNTPs (50 μM).
• Añadir 5 μl de tampón de reacción con MgCl2 (10X).
• Añadir 1 μl de molde de ADN (100 ng/μl).
• Añadir 1 μl de ADN polimerasa (0,5 U/μl).

Nota: Si está dispuesto a realizar un número importante de reacciones de PCR, se recomienda preparar una mezcla de reacción, excluyendo los reactivos que serán diferentes de un experimento a otro (normalmente el molde de ADN o el conjunto de cebadores).

1. Pipetear suavemente la mezcla de reacción para permitir una buena homogeneización.
2. Se recomienda un giro corto en una centrífuga.
3. Asegúrese de que los tapones de los tubos de PCR estén cerrados.
4. Introduzca el tubo en el termociclador.

Nota: Preste siempre atención a las directrices de la ADN polimerasa, ya que la temperatura y el tiempo de desnaturalización, recocido y extensión dependen en gran medida de ella. En el termociclador, deberá configurar estos pasos posteriormente (consulte el diagrama anterior):

1. Un paso inicial de desnaturalización del ADN a 94°C a 98°C durante 3 a 5 minutos, dependiendo de la temperatura óptima de la ADN polimerasa
2. Temperatura de desnaturalización (la misma utilizada en el paso anterior) durante 30 segundos
3. Temperatura de recocido teniendo en cuenta la Tm de los cebadores durante 30 segundos
4. Temperatura de extensión a 72°C y teniendo en cuenta el tamaño del fragmento a amplificar

Estos pasos deben repetirse durante 25 a 35 rondas (ciclos). Se requiere un último paso de extensión para permitir que todos los productos de la PCR se sinteticen correctamente, normalmente a 72°C durante 10 min. Por último, la temperatura debe reducirse a 4°C para almacenar el producto de la PCR.

1. Cargar la mezcla de 6 μl en un gel de agarosa al 1%.
2. Cargar 5 μl de marcador de ADN en el mismo gel.
3. Utilice un transiluminador UV para visualizar el producto de la PCR en el gel de agarosa.

Nota: Para evitar la tinción con bromuro de etidio, puede utilizar geles preteñidos Midori o Red Safe, que son compuestos menos tóxicos. Utilice un marcador de ADN para comparar el tamaño correcto del producto de la PCR.

La transcripción inversa es el proceso por el cual el ARN se transcribe a ADN, lo que nos permitirá realizar experimentos como la qRT-PCR bajo la actividad catalítica de una ADN polimerasa específica que sólo es capaz de amplificar fragmentos de moléculas de ADN.

Nota: Desde el inicio de tu experimento de PCR hasta el final, debes usar siempre guantes para evitar la contaminación del ADN. Todos los reactivos, cebadores y enzimas deben mantenerse en hielo.

1. En un tubo de PCR de 200 μl:
   a. Añade 2 μg de ARN total.
   b. Añada 1 ul de oligo dt (50μM).
   c. Añadir 1 μl de dNTP (10mM).
   d. Añadir agua tratada con DEPC hasta 10 μl.
2. Incubar a 65 °C durante 5 min y luego mantener los tubos en hielo durante 1 min.
3. Añadir 2 ul de tampón RT (10X) .
4. Añadir 4 μl de MgCl2.
5. Añadir 2 μl de DTT (0,1 M).
6. Añadir 1 ul de inhibidor de RNasa (40 U/μl).
7. Añadir 1 ul de transcriptasa inversa (200 U/μl).
8. Incubar a 50°C durante 60 min, seguido de 85°C durante 5 min.
9. Después, mantener el tubo en hielo.
10. Añadir 1 μl de RNasa H.
11. Incubar durante 30 min a 37°C.
12. Guarde el tubo de PCR a -20°C.
13. Para la cuantificación y calidad del ARN, utilice un equipo NanoDrop para medir las concentraciones de ARN (260 nm), proteínas y sales.

De forma similar a la PCR estándar, debe diseñarse un conjunto de cebadores como se ha descrito anteriormente para amplificar cada fragmento de ADNc de interés, que suele corresponder a un gen específico. Además, también se recomienda diseñar cebadores específicos para otros genes de ADNc para los procedimientos de normalización de datos, que también se conocen como genes “de mantenimiento” (por ejemplo, 18S, GAPDH, ACTB).

Para cada gen de ADNc, prepare la siguiente mezcla de reacción en tubos de PCR de 200 μl para un volumen final de 50 μl:

• Añadir 25 μl de SYBR Green Mix (2x).
• Añada 1 μl de ADNc de la muestra de ADNc anterior.
• Añadir 1 μl de Forward Primer (10 mM).
• Añadir 1 μl de Reverse Primer (10 mM).
• Añadir 22,5 μl de agua DEPC.
• Introduzca los tubos en el termociclador.

Una vez finalizada la PCR, realizar el análisis de cuantificación por el método Ct comparativo. El método Ct compara los valores Ct de las muestras con las muestras estándar. Los valores Ct de los controles y de las muestras se normalizan utilizando los valores Ct obtenidos para los genes housekeeping. Para validar el cálculo del Ct, se requiere que las eficiencias de amplificación de la diana sean cercanas a las endógenas. Esto se puede conseguir mediante la utilización de diferentes diluciones de la plantilla.

Las características del “Mouse IFN-beta ELISA”

Los emparejamientos optimizados de anticuerpos de captura y detección con las concentraciones recomendadas ahorran mucho tiempo de desarrollo
Se proporcionan protocolos de desarrollo para guiar la optimización del ensayo
El ensayo puede adaptarse a sus necesidades específicas
Alternativa económica a los kits completos

SOCS1 es un miembro de la familia de los inhibidores de STAT (SSI), también conocidos como supresores de la señalización de citoquinas (SOCS). Los miembros de la familia SSI son reguladores negativos de la señalización de citoquinas. SOCS1 funciona a la salida de los receptores de citoquinas y participa en un bucle de retroalimentación negativa para atenuar la señalización de las citoquinas.

Los anticuerpos policlonales se producen inmunizando a los animales con un péptido sintético correspondiente a los residuos que rodean a Ala156 de SOCS1 humana. Los anticuerpos se purificaron mediante cromatografía de afinidad de proteínas A y péptidos.

Varios proveedores ofrecen antibodies anti-SLC1A5. Este gen codifica la proteína “solute carrier family 1 member 5” en humanos y también puede ser conocido como ASCT2, AAAT, ATBO, M7V1, neutral amino acid transporter B(0), y ATB(0). Estructuralmente, la proteína tiene una masa de 56,6 kilodaltons. Basándose en el nombre del gen, también se pueden encontrar ortólogos caninos, porcinos, de mono, de ratón y de rata.

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