En el último año ha habido muchos desarrollos y noticias en torno a las pruebas PCR, estos días ha surgido un nuevo enfoque por parte de químicos de la LMU que podría ayudar a mejorar significativamente las pruebas de diagnóstico basadas en la PCR. Las enzimas utilizadas se activan mediante pulsos de luz.
Las ADN polimerasas y otras enzimas modificadoras del ADN son herramientas esenciales en biotecnología y diagnóstico. Son el componente clave para el diagnóstico por PCR de COVID-19. Por muy útiles que sean, las enzimas que procesan el ADN suelen tener defectos importantes. Algunas de ellas muestran una actividad significativa durante la preparación de la muestra, mientras que otras tienen actividades secundarias desagradables. Ambas pueden conducir a la pérdida de especificidad y sensibilidad, lo que debe evitarse en una prueba de diagnóstico.
El truco consiste en bloquear cualquier tipo de actividad enzimática hasta que se inicie el ensayo. En el caso de las pruebas de diagnóstico basadas en la PCR, como la mencionada prueba COVID-19, la solución es el desarrollo de una enzima de arranque en caliente, que no muestra actividad hasta que se alcanza una temperatura de activación elevada. El principal inconveniente de estos métodos de arranque en caliente es que no pueden utilizarse para enzimas dañadas por el calor, afirma el bioquímico de la LMU Andrés Vera. “Además, el trazado de una enzima de arranque en caliente es tedioso y hay que repetir el laborioso método de trazado para cada nueva enzima que necesitemos trazar”.
Junto con Merve-Zeynep Kesici, del grupo del profesor Philip Tinnefeld en el Departamento de Química de la LMU, Andrés encontró una forma de evitar estos problemas diseñando enzimas de arranque en caliente. Sus enzimas de arranque en caliente se bloquean hasta que un pulso de luz ultravioleta las reactiva. “Las enzimas controladas por la luz existen desde hace mucho tiempo, pero lo que hace que nuestro enfoque sea único es que puede aplicarse a prácticamente cualquier enzima de procesamiento de ADN. En el pasado, siempre se necesitaba información muy detallada sobre el funcionamiento de la enzima, y además no se sabía si se podía proporcionar una forma inteligente de represar la enzima y reactivarla con luz”, dice Vera, el líder del emprendimiento.
En su enfoque, los investigadores adjuntaron un trozo de ADN a la propia enzima, que compite en exceso con cualquier otro sustrato de la enzima, lo que la deja inactiva (incluidas sus actividades secundarias).
El pulso de luz se utiliza para cortar el ADN unido a la enzima, dando como resultado una enzima 100% activa. La principal ventaja es que el mecanismo debería funcionar para una amplia gama de enzimas de unión al ADN, independientemente de su modo de acción específico.
Para demostrarlo, los investigadores produjeron cuatro versiones activables por luz de diferentes enzimas de procesamiento de ADN. Entre ellas se encontraba la llamada ADN polimerasa Phi29, una enzima muy utilizada para amplificar genomas completos, pero demasiado sensible al calor para ser adecuada para los métodos de arranque en caliente. Además, el equipo demostró la PCR de arranque ligero y demostró que sus ADN polimerasas eran tan buenas o mejores en comparación con las enzimas comerciales de PCR de arranque en caliente.
Philip Tinnefeld se congratula de este nuevo avance: “Esto ayudará sin duda a producir mejores enzimas para uso biotecnológico y de diagnóstico. Además, las máquinas de PCR en tiempo real existentes ya incorporan fuentes de luz y podrían modificarse fácilmente para introducir estas enzimas en el mercado en cualquier momento.
