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ELISA ensayo inmunoenzimático

Visión general ELISA

¿Qué es un ensayo inmunoenzimático (ELISA)?

El ELISA (ensayo inmunoenzimático) es una técnica de ensayo en placa diseñada para detectar y cuantificar sustancias solubles como péptidos, proteínas, anticuerpos y hormonas. También se utilizan otros nombres, como inmunoensayo enzimático (EIA), para describir la misma tecnología.

En un ELISA, el antígeno (macromolécula diana) se inmoviliza en una superficie sólida (microplaca) y luego forma un complejo con un anticuerpo que está unido a una enzima informadora. La detección se lleva a cabo midiendo la actividad de la enzima informadora mediante la incubación con el sustrato apropiado para producir un producto medible.

El elemento más crucial de un ELISA es una interacción anticuerpo-antígeno altamente específica.

Introducción

El ensayo inmunoenzimático (ELISA) es un potente método para detectar y cuantificar una proteína específica en una mezcla compleja. Descrito originalmente por Engvall y Perlmann (1971), el método permite analizar muestras de proteínas inmovilizadas en pocillos de microplacas utilizando anticuerpos específicos.

Los ELISA se realizan normalmente en placas de poliestireno de 96 o 384 pocillos, que unen pasivamente los anticuerpos y las proteínas. Esta unión e inmovilización de reactivos es lo que hace que los ELISA sean fáciles de diseñar y realizar.

La inmovilización de los reactivos del ELISA en la superficie de la microplaca facilita la separación del material unido del no unido durante el ensayo. Esta capacidad de utilizar anticuerpos de alta afinidad y de lavar los materiales unidos inespecíficamente hace que el ELISA sea una herramienta poderosa para medir analitos específicos dentro de una preparación cruda.

Aunque se han desarrollado muchas variantes de ELISA y se han utilizado en diferentes situaciones, todas dependen de los mismos elementos básicos:

  1. Recubrimiento/captura: inmovilización directa o indirecta de antígenos en la superficie de los pocillos de las microplacas de poliestireno.
  2. Bloqueo de la placa: adición de una proteína irrelevante u otra molécula para cubrir todos los sitios de unión superficial no saturados de los pocillos de la microplaca.
  3. Sonda/detección: incubación con anticuerpos específicos de antígeno que se unen por afinidad a los antígenos.
  4. Medición de la señal-detección de la señal generada a través de la etiqueta directa o secundaria del anticuerpo específico.

Las etiquetas enzimáticas más utilizadas son la peroxidasa de rábano picante (HRP) y la fosfatasa alcalina (AP). También se han utilizado otras enzimas, como la β-galactosidasa, la acetilcolinesterasa y la catalasa.

Hay una gran selección de sustratos disponibles en el mercado para realizar ELISA con un conjugado HRP o AP. La elección del sustrato depende de la sensibilidad requerida para el ensayo y de la instrumentación disponible para la detección de la señal (espectrofotómetro, fluorómetro o luminómetro).

Tipos de ELISA - ELISA directo, indirecto y en sándwich

Hay varios formatos utilizados para los ELISA. Estos se dividen en métodos de captura y detección directos, indirectos o en sándwich. El paso clave es la inmovilización del antígeno de interés, que se realiza por adsorción directa a la placa de ensayo o indirectamente a través de un anticuerpo de captura que se ha unido a la placa. A continuación, el antígeno se detecta directamente (anticuerpo primario marcado) o indirectamente (como el anticuerpo secundario marcado).

El formato de ensayo ELISA más utilizado es el ensayo ELISA en sándwich, que inmoviliza y detecta indirectamente la presencia del antígeno diana. Este tipo de ensayo de captura se denomina ensayo “sándwich” porque el analito a medir está unido entre dos anticuerpos primarios, cada uno de los cuales detecta un epítopo diferente del antígeno: el anticuerpo de captura y el anticuerpo de detección. El formato ELISA tipo sándwich es muy utilizado por su sensibilidad y especificidad.

ELISA direct ELISA indirect sandwich ELISA

Estrategias de detección ELISA directas frente a indirectas

Entre los formatos de ensayo estándar discutidos e ilustrados anteriormente, donde las diferencias tanto en la captura como en la detección eran la preocupación, es importante diferenciar entre las estrategias particulares que existen específicamente para el paso de detección.

Independientemente del método mediante el cual se captura un antígeno en la placa (por adsorción directa a la superficie o a través de un anticuerpo de “captura” pre-recubierto, como en un ELISA tipo sándwich), es el paso de detección (como detección directa o indirecta) el que determina en gran medida la sensibilidad de un ELISA.

El método de detección directa utiliza un anticuerpo primario marcado con una enzima reportera o una etiqueta que reacciona directamente con el antígeno. La detección directa puede realizarse con un antígeno directamente inmovilizado en la placa de ensayo o con el formato de ensayo de captura. La detección directa, aunque no se utiliza ampliamente en ELISA, es bastante común para la tinción inmunohistoquímica de tejidos y células.

El método de detección indirecta utiliza un anticuerpo secundario marcado o un complejo de biotina-estreptavidina para la amplificación y es el formato más popular para ELISA. El anticuerpo secundario tiene especificidad para el anticuerpo primario.

En un ELISA tipo sándwich, es fundamental que el anticuerpo secundario sea específico para la detección del anticuerpo primario solamente (y no del anticuerpo de captura) o el ensayo no será específico para el antígeno. Generalmente, esto se consigue utilizando anticuerpos de captura y primarios de diferentes especies de huéspedes (por ejemplo, IgG de ratón e IgG de conejo, respectivamente).

Para los ensayos tipo sándwich, es beneficioso utilizar anticuerpos secundarios que se hayan adsorbido de forma cruzada para eliminar cualquier anticuerpo secundario que pueda tener afinidad por el anticuerpo de captura.

Detección directa por ELISA

Ventajas

  • Rápido porque sólo se utiliza un anticuerpo y menos pasos.
  • Se elimina la reactividad cruzada del anticuerpo secundario.

Desventajas

  • La inmunorreactividad del anticuerpo primario puede verse afectada negativamente por el etiquetado con enzimas informadoras o etiquetas.
  • El etiquetado de anticuerpos primarios para cada sistema ELISA específico requiere mucho tiempo y es caro.
  • Número limitado de anticuerpos primarios conjugados disponibles en el mercado.
  • No hay flexibilidad en la elección de la etiqueta del anticuerpo primario de un experimento a otro.
  • Amplificación mínima de la señal.

Detección indirecta por ELISA

Ventajas

  • Existe una gran variedad de anticuerpos secundarios marcados disponibles en el mercado.
  • Versátil porque se pueden hacer muchos anticuerpos primarios en una especie y utilizar el mismo anticuerpo secundario marcado para la detección.
  • Se conserva la máxima inmunorreactividad del anticuerpo primario porque no está marcado.
  • La sensibilidad aumenta porque cada anticuerpo primario contiene varios epítopos que pueden ser unidos por el anticuerpo secundario marcado, lo que permite la amplificación de la señal.
  • Se pueden utilizar diferentes métodos de detección con el mismo anticuerpo primario (colorimétrico, quimioluminiscente, etc.)

Desventajas

  • Podría producirse una reactividad cruzada con el anticuerpo secundario, lo que daría lugar a una señal inespecífica.
  • Se requiere un paso de incubación adicional en el procedimiento.

Sandwich ELISA

Ventajas

  • Alta sensibilidad y alta especificidad para el antígeno diana, ya que se utilizan dos anticuerpos para la captura y la detección.
  • Se pueden utilizar diferentes métodos de detección con el mismo anticuerpo de captura.

Desventajas

  • Requiere una mayor optimización para identificar los pares de anticuerpos y para garantizar que haya una reactividad cruzada limitada entre los anticuerpos de captura y de detección.

ELISA competitivo y otros formatos

Además de los formatos estándar directo y sándwich descritos anteriormente, existen otros estilos de ELISA:

El ELISA competitivo es una estrategia que suele utilizarse cuando el antígeno es pequeño y tiene un solo epítopo o sitio de unión de anticuerpos. Una variación de este método consiste en etiquetar el antígeno purificado en lugar del anticuerpo.

El antígeno no marcado de las muestras y el antígeno marcado compiten por la unión al anticuerpo de captura. Una disminución de la señal del antígeno purificado indica la presencia del antígeno en las muestras cuando se compara con los pocillos de ensayo con antígeno marcado solamente.

Resumen del método ELISA competitivo
ELISA inmunoenzimático

En el ELISA competitivo, también denominado ELISA de inhibición, la concentración del antígeno diana se determina mediante la detección de interferencias en la señal. El antígeno diana de la muestra compite con una referencia o estándar marcado para unirse a una cantidad limitada de anticuerpos inmovilizados en la placa.

ELISPOT (enzyme-linked immunospot assay) se refiere a la captura y medición, tipo ELISA, de las proteínas secretadas por las células que se colocan en pozos de microplacas con respaldo de membrana de PVDF. Se trata de un ensayo tipo “sándwich” en el que las proteínas se capturan localmente a medida que son secretadas por las células sembradas, y la detección se realiza con un sustrato precipitante. El ELISPOT es como un western blot en el que el resultado son manchas en una superficie de membrana.

“In-cell ELISA” se realiza con células que se cultivan durante la noche en microplacas estándar. Después de fijar, permeabilizar y bloquear las células cultivadas, se detectan las proteínas objetivo con anticuerpos. Se trata de un ensayo indirecto, no de un ensayo en sándwich. Los anticuerpos secundarios son fluorescentes (para la medición directa mediante un lector de placas fluorescentes o un microscopio) o conjugados con enzimas (para la detección con un sustrato soluble utilizando un lector de placas).

El ELISA se realiza casi siempre utilizando placas de poliestireno de 96 o 384 pocillos y muestras en solución (es decir, fluidos biológicos, medios de cultivo o lisados celulares). Esta es la plataforma que se analiza en el resto de este artículo.

Anticuerpos primarios para ELISA

Los anticuerpos monoclonales o policlonales pueden utilizarse como anticuerpos de captura y detección en los sistemas ELISA tipo sándwich y otros sistemas ELISA. Los anticuerpos monoclonales tienen una monoespecificidad inherente hacia un único epítopo que permite la detección fina y la cuantificación de pequeñas diferencias en el antígeno.

Los anticuerpos policlonales se utilizan a menudo como anticuerpos de captura para extraer la mayor cantidad posible de antígeno. A continuación, se utiliza un monoclonal como anticuerpo de detección en el ensayo en sándwich para mejorar la especificidad. Además del uso de anticuerpos monoclonales tradicionales, también pueden utilizarse anticuerpos monoclonales recombinantes para ELISA.

Los anticuerpos recombinantes se derivan de líneas celulares productoras de anticuerpos diseñadas para expresar secuencias de ADN de cadenas pesadas y ligeras específicas de anticuerpos. En comparación con los anticuerpos monoclonales tradicionales derivados de hibridomas, los anticuerpos recombinantes no son susceptibles a la deriva de la línea celular o a la variación entre lotes, lo que permite una especificidad máxima del antígeno.

Una consideración importante en el diseño de un ELISA tipo sándwich es que los anticuerpos de captura y detección deben reconocer dos epítopos diferentes que no se superpongan. Cuando el antígeno se une al anticuerpo de captura, el epítopo reconocido por el anticuerpo de detección no debe ser oscurecido o alterado.

Los anticuerpos de captura y detección que no interfieren entre sí y pueden unirse simultáneamente se denominan “pares emparejados” y son adecuados para desarrollar un ELISA tipo sándwich. Muchos proveedores de anticuerpos primarios proporcionan información sobre los epítopos e indican pares de anticuerpos que han sido validados en ELISA como pares emparejados. El uso del mismo anticuerpo para la captura y la detección puede limitar el rango dinámico y la sensibilidad del ELISA final.

Tampón de bloqueo y tampón de lavado

La capacidad de unión de los pozos de las microplacas suele ser mayor que la cantidad de proteína recubierta en cada pozo. La superficie restante debe bloquearse para evitar que los anticuerpos u otras proteínas se adsorban a la placa durante los pasos posteriores. Un tampón de bloqueo es una solución de proteína irrelevante, mezcla de proteínas u otro compuesto que se adsorbe pasivamente a todas las superficies de unión restantes de la placa. El tampón de bloqueo es eficaz si mejora la sensibilidad de un ensayo al reducir la señal de fondo y mejorar la relación señal/ruido. El tampón de bloqueo ideal se unirá a todos los sitios potenciales de interacción inespecífica, eliminando por completo el fondo, sin alterar ni oscurecer el epítopo para la unión del anticuerpo.

Al desarrollar cualquier nuevo ELISA, es importante probar varios bloqueadores diferentes para obtener la mayor relación señal/ruido en el ensayo. Son muchos los factores que pueden influir en la unión inespecífica, incluidas las diversas interacciones proteína-proteína propias de las muestras y los anticuerpos implicados.

El parámetro más importante a la hora de seleccionar un bloqueador es la relación señal/ruido, que se mide como la señal obtenida con una muestra que contiene el analito objetivo en comparación con la obtenida con una muestra sin el analito objetivo. El uso de cantidades inadecuadas de bloqueador dará lugar a un fondo excesivo y a una relación señal/ruido reducida. El uso de concentraciones excesivas de bloqueador puede enmascarar las interacciones anticuerpo-antígeno o inhibir la enzima, causando de nuevo una reducción de la relación señal/ruido. Ningún agente de bloqueo es ideal para todas las ocasiones, y las pruebas empíricas son esenciales para una verdadera optimización del paso de bloqueo.

Además del bloqueo, es esencial realizar lavados exhaustivos entre cada paso del ELISA. Los pasos de lavado son necesarios para eliminar los reactivos no unidos y disminuir el fondo, aumentando así la relación señal/ruido. Un lavado insuficiente provocará un fondo elevado, mientras que un lavado excesivo podría provocar una disminución de la sensibilidad causada por la elución del anticuerpo y/o del antígeno del pocillo. El lavado se realiza en un tampón fisiológico como la solución salina tamponada con Tris (TBS) o la solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin ningún aditivo. Normalmente, se añade al tampón un detergente como el Tween-20 al 0,05% para ayudar a eliminar el material unido de forma no específica. Otra técnica común es utilizar una solución diluida del tampón de bloqueo junto con algún detergente añadido. La inclusión del agente de bloqueo y la adición de un detergente en los tampones de lavado ayuda a minimizar el fondo en el ensayo. Para obtener los mejores resultados, utilice detergentes de alta pureza para evitar la introducción de impurezas que interfieran con el ensayo, como inhibidores enzimáticos o peróxidos.

Referencias
BDNF ELISA Kits

El ELISA (ensayo inmunoenzimático) es una aplicación muy utilizada para detectar y cuantificar proteínas y antígenos de diversas muestras. Los kits ELISA específicos para cada objetivo están disponibles en una gran variedad de fabricantes y pueden ayudar a agilizar sus experimentos de inmunodetección.

Mouse IFN beta ELISA

Las características del “Mouse IFN-beta ELISA”

  • Los emparejamientos optimizados de anticuerpos de captura y detección con las concentraciones recomendadas ahorran mucho tiempo de desarrollo
  • Se proporcionan protocolos de desarrollo para guiar la optimización del ensayo
  • El ensayo puede adaptarse a sus necesidades específicas
  • Alternativa económica a los kits completos
mpo elisa

El MPO ELISA (Hu MPO) cuantifica la Hu MPO en suero humano, plasma, solución amortiguada o medio de cultivo celular. El ensayo reconoce exclusivamente tanto la MPO natural como la recombinante.

El “mpo ELISA” (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) in vitro de la mieloperoxidasa humana está diseñado para la medición cuantitativa precisa de la mieloperoxidasa en sobrenadantes de cultivos celulares, lisados celulares, homogeneizados de tejidos, suero, plasma (heparina, EDTA), saliva y orina.

leptin ELISA

El leptin ELISA de leptina de ratón es un ELISA tipo sándwich de un solo lavado y 90 minutos de duración, diseñado para la medición cuantitativa de la proteína leptina en el sobrenadante de cultivos celulares, plasma cítrico, suero y orina.
El leptin ELISA es una aplicación ampliamente utilizada para detectar y cuantificar proteínas y antígenos de diversas muestras. Los kits ELISA específicos para cada objetivo están disponibles en una gran variedad de fabricantes y pueden ayudar a agilizar sus experimentos de inmunodetección.

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