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Técnicas de Southern Blotting
El Southern Blotting es una técnica fundamental en biología molecular. Fue inventada por primera vez por E.M. Southern en 1975 como un método importante para transferir moléculas de ADN, especialmente fragmentos de restricción, de un gel de electroforesis a una lámina de nitrocelulosa o nailon, normalmente llamada membrana.
Durante el proceso, el patrón de bandas de ADN presente en el gel se replica en la membrana. Tras el pretratamiento, el ADN queda inmovilizado en la membrana y puede utilizarse como sustrato para el análisis de hibridación con sondas de ADN o ARN marcadas que se dirigen a fragmentos de restricción individuales en el ADN borrado.
El objetivo del pretratamiento es romper las moléculas de ADN en bandas individuales dentro del gel en fragmentos más pequeños, ya que los fragmentos más pequeños se transfieren más rápidamente que los más grandes. Por lo tanto, el gel se empapa primero en 0,25mol L-1 de HCL durante 30 minutos. En segundo lugar, se realiza un pretratamiento con una solución alcalina para desnaturalizar las moléculas de ADN de doble cadena rompiendo sus enlaces de hidrógeno para que se conviertan en monocatenarias. Esto también ayuda a su transferencia y posterior unión a la membrana. Además, garantiza que, tras la unión, los componentes de emparejamiento de bases de los polinucleótidos estén disponibles para la hibridación con la sonda.
La electroforesis en gel es una técnica de la ciencia biológica. Los geles se utilizan para separar todo tipo de moléculas, incluido el ADN. El gel de agarosa es el más utilizado en el análisis Southern.
Es un polisacárido que forma una matriz suelta cuando se calienta con agua. Un trozo de agarosa se calienta y se prepara calentando aproximadamente 1g de polvo de agarosa en 100ml de solución salina compuesta por 40mM-Tris-acetato, 1mM-EDTA, pH 8.0. La mezcla caliente se vierte en un molde rectangular y se deja reposar. Se coloca un formador de pozos en un extremo para producir pequeñas hendiduras en el gel. A continuación, el gel se coloca en un tanque especial con electrodos en ambos extremos y se sumerge completamente en la solución salina. El ADN pretratado con la enzima de restricción se coloca en las ranuras y el tanque se conecta a una fuente de alimentación que proporciona un suministro eléctrico controlado para impulsar la electroforesis. Los fragmentos de ADN tienen una carga negativa, por lo que comienzan a migrar a través del gel hacia el terminal positivo. Finalmente, los fragmentos de ADN se distribuyen en un carril del gel con los fragmentos más grandes en un extremo y los más pequeños en el otro. Es importante identificar cualquier fragmento de ADN con una mutación que pueda afectar gravemente a la vida del feto.
Para retirar el ADN del gel, se coloca un trozo de material filtrante de nitrocelulosa fino sobre el gel, sentado en una mecha empapada en la solución salina. Se coloca una pila de papel secante encima del filtro y se coloca un peso encima. El peso presiona la pila y la solución salina comienza a moverse hacia arriba a través del gel y hacia el papel secante mientras arrastra los fragmentos de ADN. Los fragmentos se adhieren a la superficie del filtro. Esto se hace durante unas horas para asegurar que todo el ADN sea lavado del gel. Durante esta técnica, se obtiene un filtro que tiene todo el ADN originalmente en el gel adherido a él en la forma exacta en la que estaba mientras estaba dentro del gel. Así, el procedimiento se asemeja al borrado de una firma de tinta, de ahí el término Southern Blotting.
En otra técnica, como la transferencia al vacío, el ADN se extrae del gel al vacío y se coloca en un material de filtro extremadamente resistente, hecho de nylon, pero menos frágil que la nitrocelulosa. El filtro de nylon es eficaz para fijar el ADN, así como los fragmentos de ADN, por lo que son posibles muchos análisis diferentes del ADN unido. Sin embargo, con esta técnica no es fácil determinar si hay o no mutaciones en el gen del ADN.