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ELISA

ELISA (Ensayo inmunoenzimático)

Introducción

El ensayo inmunoenzimático (ELISA) es un potente método para detectar y cuantificar una proteína específica en una mezcla compleja. Descrito originalmente por Engvall y Perlmann (1971), el método permite analizar muestras de proteínas inmovilizadas en pocillos de microplacas utilizando anticuerpos específicos.

Los ELISA se realizan normalmente en placas de poliestireno de 96 o 384 pocillos, que unen pasivamente los anticuerpos y las proteínas. Esta unión e inmovilización de reactivos es lo que hace que los ELISA sean fáciles de diseñar y realizar.

La inmovilización de los reactivos del ELISA en la superficie de la microplaca facilita la separación del material unido del no unido durante el ensayo. Esta capacidad de utilizar anticuerpos de alta afinidad y de lavar los materiales unidos inespecíficamente hace que el ELISA sea una poderosa herramienta para medir analitos específicos dentro de una preparación cruda.

¿Qué es ELISA? (Ensayo de Inmunoabsorción Enzimática)

La prueba ELISA (Ensayo de inmunoabsorción enzimática) es un análisis que detecta y mide anticuerpos en la sangre y puede utilizarse para determinar si el paciente tiene anticuerpos relacionados con determinadas enfermedades infecciosas.

El ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) es un método de prueba basado en anticuerpos. Esta tecnología de uso extendido es sensible, rápida y fiable

Los anticuerpos son proteínas que el organismo produce en respuesta a sustancias dañinas (llamadas antígenos). Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de variables, tales como selección de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente, puede afectar los pasos sucesivos y el resultado de la prueba.

El ensayo inmunoenzimático (ELISA), también conocido como inmunoensayo enzimático (EIA), es una técnica bioquímica utilizada principalmente en inmunología para detectar la presencia de un anticuerpo o un antígeno en una muestra. El ELISA se ha utilizado como herramienta de diagnóstico en medicina y fitopatología, así como para el control de calidad en diversas industrias, como la aplicación en la industria alimentaria.

La técnica fue propuesta como una alternativa al radioinmunoensayo, ya que este último suponía un riesgo para la salud debido a los isotopos radiactivos utilizados.

Esta técnica se diferencia de otras basadas en la reacción Ag-Ac en que la unión a una superficie sólida permite la identificación de reacciones específicas y, por lo tanto, la obtención de resultados cuantitativos.

El método ELISA es un punto de referencia para la cuantificación de antígenos patológicos y, de hecho, existen muchas variaciones de este método. Estos se adaptan al cribado de alto rendimiento porque los resultados son rápidos, consistentes y relativamente fáciles de analizar.

Los mejores resultados se han obtenido con el formato de sándwich, utilizando anticuerpos de captura y detector altamente purificados y previamente emparejados. La señal resultante proporciona datos muy sensibles y altamente específicos.

Principios del ensayo ELISA

Los anticuerpos son proteínas producidas en las células plasmáticas de los vertebrados como parte del sistema inmunitario adaptativo frente a estructuras (antígenos) que el cuerpo reconoce como elementos extraños.

Los anticuerpos se enlazan a los antígenos correspondientes utilizando un patrón diferenciado de interacciones iónicas e hidrofóbicas, enlaces de puente de hidrógeno y fuerzas de Van-der-Waals. La interacción entre el anticuerpo y el antígeno correspondiente es selectiva y muy específica, similar a la de una cerradura y una llave.

El ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas se basa en este reconocimiento anticuerpo-antígeno selectivo y específico Se han establecido muchos formatos de ensayos ELISA cualitativos y cuantitativos.

La realización de un ensayo ELISA requiere como mínimo un anticuerpo específico para un antígeno concreto. De acuerdo con el método básico, uno de los componentes inmunológicos se inmoviliza en una fase sólida, en las cavidades de la placa de microtitulación. El analito de la muestra interactúa con el sistema anticuerpo-antígeno. Esta interacción se puede visualizar mediante enzimas, enlazadas a antígenos o anticuerpos secundarios, e indica si se ha producido un enlace antígeno-anticuerpo. La enzima enlazada convierte un sustrato agregado, lo que da lugar a un cambio de color, que se puede medir mediante un espectrofotómetro.

Tipos de ensayos ELISA

El experimento ELISA se inicia con el paso de inmovilizar el antígeno de una muestra determinada en los pocillos de una placa multipocillo. El proceso de inmovilización puede lograrse mediante dos métodos que incluyen la adsorción directa a la superficie de una placa o mediante una sonda de captura de anticuerpos adsorbida a la placa. La sonda de anticuerpos debe ser altamente específica hacia el antígeno de interés. La inmovilización es seguida por la adición del anticuerpo de detección que da lugar a un complejo antígeno-anticuerpo. El anticuerpo aplicable para la detección se suele marcar explotando enzimas como la fosfatasa alcalina (AP) o la peroxidasa de rábano picante (HRP).

Los ELISA pueden clasificarse en cuatro categorías principales, a saber, directo, indirecto, sándwich y competitivo, dependiendo de las modificaciones realizadas en los procedimientos básicos. El ELISA en sándwich es el formato más potente de los ensayos ELISA debido a su alta sensibilidad y robustez La elección del sustrato para el ensayo depende de la sensibilidad requerida, el tipo de instrumentación necesaria y su disponibilidad.

ELISA directo

Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la solución analizada.

Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo que las analizadas (sangre, orina…), pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno buscado)

Ventajas
  • Rápido y con mínimos pasos en el procedimiento.
  • El requisito mínimo de precursores hace que sea menos propenso a errores.
Desventajas
  • La inmovilización del antígeno no es específica, por lo que se observan problemas relacionados con el fondo.
  • Ofrece menos flexibilidad en cuanto al anticuerpo primario.
  • La ausencia de amplificación de la señal reduce la sensibilidad.
ELISA indirecto

Las placas ELISA se preparan de la misma forma a la anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado contra el primario.

La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario. Es el ensayo más popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimático permiten cuantificar una gran variedad de antígenos; por eso es un método más polivalente y barato, aunque se pierda algo de precisión por tener un eslabón más con respecto al método directo.

La dilución de la solución que contiene el anticuerpo primario —por ejemplo, suero sanguíneo— es un factor muy importante a tener en cuenta para evitar la aparición de falsos negativos, ya que si la muestra está muy diluida, no saldrá positiva si la titulación de anticuerpos es muy baja. (Es decir, aunque los anticuerpos están presentes, la prueba no da positivo porque la concentración de anticuerpos específicos contra el antígeno que está pegado en el fondo del pocillo no es suficiente como para dar una señal detectable.).

El ELISA indirecto es el método de elección para detectar la presencia de anticuerpos séricos contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), agente causante del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA).

Según esta técnica, proteínas recombinantes de la envoltura y el núcleo del VIH se absorben como antígenos en fase sólida a los pocillos. Las personas afectadas de VIH producen anticuerpos séricos contra epítopos en estas proteínas víricas.

En general, el ELISA indirecto permite detectar anticuepos séricos contra VIH desde las primeras seis semanas de una infección.

Ventajas
  • Ofrece una alta sensibilidad y flexibilidad ya que el número de anticuerpos secundarios puede unirse a un anticuerpo primario y un tipo de anticuerpo secundario puede marcar diferentes anticuerpos primarios
  • Es más barato, ya que se necesitan menos anticuerpos marcados.
Desventajas
  • Mayor relación señal/ruido.
  • Requiere mucho tiempo y mano de obra adicional.
ELISA «sándwich»

(Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos).

Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo, se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo.

Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido, se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado.

Así, pues, cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca.0 Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.

Ventajas
  • Ofrece una alta sensibilidad en comparación con el ELISA directo o indirecto
  • Introduce una reacción altamente específica debido a la participación de dos anticuerpos para la detección del antígeno.
  • En la detección se aplica tanto la técnica directa como la indirecta.
Desventajas
  • La optimización en términos de anticuerpos resulta problemática debido a los problemas de reactividad cruzada.
  • Para el reconocimiento de un epítopo específico, sólo pueden aplicarse anticuerpos monoclonales como pares emparejados.
  • Conseguir anticuerpos monoclonales es un proceso tedioso en el caso de los pares emparejados y son más caros que los anticuerpos policlonales.
ELISA inhibidor

Este tipo de ELISA es el más complejo. Se utiliza para detectar o cuantificar antígenos presentes en bajas cantidades. Se denomina así ya que se utiliza un antígeno de referencia que competirá con el antígeno de la muestra por la unión al anticuerpo. El procedimiento simplificado sería el siguiente:

  1. El antígeno de referencia se inmoviliza sobre la placa.
  2. Por otro lado, un exceso de anticuerpo primario sin marcar se incuba con la muestra que contiene el antígeno de interés, dando lugar a la formación de complejos antígeno-anticuerpo
  3. Se añade la mezcla antígeno-anticuerpo a la placa, donde el antígeno de referencia competirá con el antígeno de la muestra por unirse al anticuerpo
  4. Se lava la placa eliminando los complejos antígeno-anticuerpo solubles
  5. Se añade a la placa un anticuerpo secundario marcado con una enzima que se unirá al anticuerpo primario anclado al antígeno de referencia.
  6. Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal visible.
Ventajas
  • Se requiere un procesamiento insignificante de la muestra y puede aplicarse a muestras crudas
  • Menos sensible a los errores experimentales.
  • Buena reproducibilidad y flexibilidad.
BDNF ELISA Kits

El ELISA (ensayo inmunoenzimático) es una aplicación muy utilizada para detectar y cuantificar proteínas y antígenos de diversas muestras. Los kits ELISA específicos para cada objetivo están disponibles en una gran variedad de fabricantes y pueden ayudar a agilizar sus experimentos de inmunodetección.

Mouse IFN beta ELISA

Las características del “Mouse IFN-beta ELISA”

  • Los emparejamientos optimizados de anticuerpos de captura y detección con las concentraciones recomendadas ahorran mucho tiempo de desarrollo
  • Se proporcionan protocolos de desarrollo para guiar la optimización del ensayo
  • El ensayo puede adaptarse a sus necesidades específicas
  • Alternativa económica a los kits completos
mpo elisa

El MPO ELISA (Hu MPO) cuantifica la Hu MPO en suero humano, plasma, solución amortiguada o medio de cultivo celular. El ensayo reconoce exclusivamente tanto la MPO natural como la recombinante.

El “mpo ELISA” (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) in vitro de la mieloperoxidasa humana está diseñado para la medición cuantitativa precisa de la mieloperoxidasa en sobrenadantes de cultivos celulares, lisados celulares, homogeneizados de tejidos, suero, plasma (heparina, EDTA), saliva y orina.

leptin ELISA

El leptin ELISA de leptina de ratón es un ELISA tipo sándwich de un solo lavado y 90 minutos de duración, diseñado para la medición cuantitativa de la proteína leptina en el sobrenadante de cultivos celulares, plasma cítrico, suero y orina.
El leptin ELISA es una aplicación ampliamente utilizada para detectar y cuantificar proteínas y antígenos de diversas muestras. Los kits ELISA específicos para cada objetivo están disponibles en una gran variedad de fabricantes y pueden ayudar a agilizar sus experimentos de inmunodetección.

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