Aislamiento de plasmidos ADN : protocolo, pasos…

El aislamiento de ADN plasmídico o “aislamiento de plasmidos” a partir de microorganismos es un enfoque crítico en la biología molecular y es un paso crucial en muchos procesos que incluyen la clonación, la secuenciación de ADN, la transfección y la terapia génica. Estos procesos requieren el aislamiento de ADN plasmídico de alta pureza.
El ADN plasmídico purificado puede utilizarse inmediatamente en todos los procedimientos de biología molecular, como la digestión con enzimas de restricción, la clonación, la PCR, la transfección, la traducción in vitro, el blot y la secuenciación.

Pasos para la extracción de ADN plasmídico

• Cultivo de las muestras bacterianas

En primer lugar, las células bacterianas deben cultivarse en cantidades variables de medio de crecimiento. Normalmente, se añade un antibiótico al medio de crecimiento, y el ADN del plásmido transmitirá la resistencia al antibiótico a las bacterias. Se pueden extraer las células del medio de crecimiento y desechar el sobrenadante mediante centrifugación. Al finalizar este paso, las células se convierten en pellets móviles.

• Resuspender las células peleadas en la solución tampón.

A continuación, resuspenda las células en una solución isotónica que contenga Tris, EDTA (para desestabilizar la pared celular y evitar que se dañe el plásmido), glucosa (para evitar que las células estallen) y RNasa A (para degradar el ARN celular durante la lisis celular).

• Lisis de las células

A continuación, se añadirá una solución alcalina que contenga hidróxido de sodio y dodecil sulfato de sodio (SDS) para facilitar la lisis celular y la desnaturalización del ADN genómico y plasmídico junto con todas las proteínas de la solución. La solución altamente alcalina compuesta por NaOH y SDS rompe las membranas celulares y convierte los ADNs de doble cadena (dsDNA) en ADNs de cadena simple (ssDNA).

• Neutralizar la solución con acetato de potasio

Una solución de acetato de potasio neutraliza la muestra y separa el ADN plasmídico del ADN genómico (ADNg). El ADN plasmídico más pequeño renaturaliza fácilmente, mientras que el ADN genómico, más grande y complicado, precipita fuera de la solución.

Tras la centrifugación, el ADN genómico y las proteínas precipitadas forman un pellet, mientras que el ADN plasmídico permanece soluble. El ADN plasmídico final dentro del sobrenadante puede ser llevado a cabo con etanol o purificado mediante el uso de una era de centrifugado o una mezcla de fenol y cloroformo.

• Precipitar el ADN del plásmido con precipitación de etanol.

Finalmente, para el aislamiento de plasmidos debes aislar el ADN plasmídico mediante un proceso conocido como precipitación con etanol. Una vez precipitado, debes enjuagar el precipitado (el ADN plasmídico) en etanol frío al 70% y dejarlo secar durante unos 10 minutos para que el alcohol se evapore. También debe resuspender el pellet de ADN en una solución tampón que contenga Tris, EDTA y RNasas para limpiar cualquier resto de ARN en la solución.

Consejos a tener en cuenta para el aislamiento de plasmidos

El aislamiento de plasmidos puede ser un reto, por lo que hay que tener en cuenta los siguientes consejos a la hora de extraer el ADN del plásmido:

Realice la lisis celular rápidamente para evitar la desnaturalización irreversible del plásmido.
Los tampones de resuspensión y lisis deben mezclarse bien, así que asegúrese de no combinarlos vigorosamente para evitar romper el ADN en fragmentos más pequeños. Si son lo suficientemente pequeños, el ADNg roto puede volver a unirse y permanecer en la solución.
Utilice guantes y una protección ocular adecuada cuando trabaje con compuestos químicos agresivos junto con el NaOH y el SDS.

Principios

La purificación del ADN plasmídico a partir del ADN bacteriano se basa en la desnaturalización diferencial del ADN cromosómico y del plásmido mediante lisis alcalina para separar ambos. Los pasos principales del aislamiento de plasmidos son la disrupción de la forma móvil para crear un lisado, la separación del plásmido del ADN cromosómico, las partículas móviles y el material insoluble diferente. Las bacterias se lisan o procesan con un tampón de lisis que contiene dodecil sulfato de sodio (SDS) e hidróxido de sodio.

Durante este paso, se desintegra la mayor parte de las células, se desnaturaliza el ADN cromosómico y plasmídico y se limpia el lisado resultante mediante centrifugación, filtración o extracción magnética. La posterior neutralización con acetato de potasio permite que la mayor parte del ADN plasmídico bloqueado covalentemente se vuelva a unir y continúe siendo solubilizado. La mayor parte del ADN cromosómico y de las proteínas se precipitan en una forma complicada con potasio y SDS, que se elimina mediante centrifugación.

¿Qué solución se utiliza en el aislamiento de plasmidos?

Esta solución contiene hidróxido de sodio y SDS (dodecil sulfato de sodio). El hidróxido de sodio desnaturaliza el ADN plasmídico y cromosómico en hebras simples.