Aislamiento de plásmidos

Aislamiento de plásmidos

Introducción

El aislamiento de plásmidos consta de cinco pasos: lisis celular, eliminación de residuos, precipitación de ácidos nucleicos, aislamiento de ácidos nucleicos y resuspensión.

Una preparación de plásmidos es un método de extracción y purificación de ADN para plásmidos. Se han desarrollado muchos métodos para purificar el ADN plasmídico de las bacterias.

Estos métodos implican invariablemente tres pasos:

  • Crecimiento del cultivo bacteriano
  • Recolección y lisis de las bacterias
  • Purificación del ADN plasmídico

El término “plásmido” fue acuñado por Joshua Lederberg en 1952.El aislamiento de plásmidos parte de este términado. Los plásmidos son elementos genéticos extracromosómicos presentes en la mayoría de las especies de Archae, Eukarya y Eubacteria.

Los plásmidos son moléculas circulares de ADN de doble cadena que son distintas del ADN cromosómico de las células.

La estructura y la función de una célula bacteriana están dirigidas por el material genético contenido en el ADN cromosómico. En algunos casos, los plásmidos no suelen ser esenciales para la supervivencia de la bacteria huésped.

Los plásmidos contribuyen a la diversidad genética y la plasticidad de las bacterias . Estos codifican funciones que podrían no estar especificadas por el ADN cromosómico bacteriano.

Los plásmidos especifican rasgos que permiten al huésped persistir en entornos que, de otro modo, serían letales o restrictivos para el crecimiento. Por ejemplo, la resistencia a los antibióticos y la expresión de proteínas. Los genes de resistencia a los antibióticos suelen estar codificados por el plásmido, lo que permite a la bacteria persistir en un entorno que contiene antibióticos.

Esto proporciona a la bacteria una ventaja competitiva sobre las especies sensibles a los antibióticos. Además. como herramienta, los plásmidos pueden modificarse para expresar la proteína de interés. (Por ejemplo, la producción de insulina humana mediante la tecnología del ADN recombinante).

Los plásmidos han servido como sistemas modelo inestimables para el estudio de procesos como la replicación del ADN, la segregación, la conjugación y la evolución. Los plásmidos han sido fundamentales para la moderna tecnología del ADN recombinante como herramienta para la clonación de genes y como vehículo para su expresión.

Aislamiento de plasmidos

Características de los plásmidos

Los plásmidos presentes en la bacteria difieren en sus propiedades físicas:

  • el tamaño (kbp)
  • la geometría
  • el número de copias

Tamaño del plásmido

El tamaño de los plásmidos oscila entre 1 kbp (kilo par de bases) y 1000 (kilo par de bases) megaplásmidos que tienen muchos cientos de pares de bases.

Geometría del plásmido

Aunque la mayoría de los plásmidos poseen una geometría circular, actualmente hay muchos ejemplos de plásmidos que son lineales en una variedad de bacterias.

El ADN de los plásmidos puede aparecer en una de las cinco conformaciones: ADN circular abierto mellado, que tiene una hebra cortada; ADN circular relajado, que está completamente intacto con ambas hebras sin cortar, pero que ha sido relajado enzimáticamente; ADN lineal, que tiene extremos libres; ADN superenrollado, que está completamente intacto con ambas hebras sin cortar; y ADN superenrollado desnaturalizado, que es como el ADN superenrollado, pero tiene regiones no apareadas que lo hacen ligeramente menos compacto.

Números de copias de plásmidos

El número de copias se refiere al número medio o esperado de copias por célula huésped. Los plásmidos tienen un número de copias bajo, medio o alto. Saber a qué categoría pertenece el plásmido es muy importante cuando se inicia un experimento.

Si se trabaja con un plásmido de bajo número de copias que se asocia con un bajo rendimiento y, por lo tanto, podría ser necesario establecer más cultivos. Por otro lado, si se obtiene un bajo rendimiento con un plásmido de alto número de copias, se requiere la resolución de problemas.

En las bacterias con plásmidos de alto número de copias, durante la división celular los plásmidos se segregan al azar en las células hijas, mientras que en las bacterias con bajo número de copias, durante la división celular y la partición los plásmidos se dividen por igual en las células hijas.

Una ventaja del alto número de copias es la mayor estabilidad del plásmido cuando se produce la partición aleatoria (es decir, la partición de los plásmidos en las células hijas) en la división celular.

Aislamiento de plásmidos

El aislamiento del ADN plasmídico de las bacterias es una técnica crucial en biología molecular y es un paso esencial en muchos procedimientos como la clonación, la secuenciación del ADN, la transfección y la terapia génica. Estas manipulaciones requieren el aislamiento de ADN plasmídico de alta pureza. El ADN plasmídico purificado puede utilizarse inmediatamente en todos los procedimientos de biología molecular, como la digestión con enzimas de restricción, la clonación, la PCR, la transfección, la traducción in vitro, el blot y la secuenciación.

La lisis alcalina es un método utilizado en biología molecular para aislar el ADN del plásmido u otros componentes celulares, como las proteínas, rompiendo las células. Las bacterias que contienen el plásmido de interés se cultivan primero y luego se dejan lisar con un tampón de lisis alcalino que consiste en un detergente dodecil sulfato de sodio (SDS) y una base fuerte de hidróxido de sodio. El detergente escinde la bicapa de fosfolípidos de la membrana y el álcali desnaturaliza las proteínas que participan en el mantenimiento de la estructura de la membrana celular. Mediante una serie de pasos que implican agitación, precipitación, centrifugación y eliminación del sobrenadante, se eliminan los restos celulares y se aísla y purifica el plásmido.

Principio

La purificación del ADN plamídico a partir del ADN bacteriano se basa en la desnaturalización diferencial del ADN cromosómico y del plamídico mediante lisis alcalina para separar ambos.

Los pasos básicos del aislamiento de plámidos son la disrupción de la estructura celular para crear un lisado, la separación del plásmido del ADN cromosómico, los restos celulares y otro material insoluble. Las bacterias se lisan con una solución tampón de lisis que contiene dodecil sulfato de sodio (SDS) e hidróxido de sodio. Durante este paso se produce la disrupción de la mayoría de las células, se desnaturaliza el ADN cromosómico y plasmídico y el lisado resultante se limpia por centrifugación, filtración o limpieza magnética. La posterior neutralización con acetato de potasio permite que sólo el ADN plasmídico cerrado covalentemente se vuelva a unir y permanezca solubilizado. La mayor parte del ADN cromosómico y las proteínas precipitan en un complejo formado con potasio y SDS, que se elimina por centrifugación.

La bacteria se resuspende en un tampón de resuspensión (50mM Tris-Cl, 10 mM EDTA, 100 µg/ ml de RNasa A, pH 8,0) y luego se trata con SDS (p/v) al 1% / tampón de lisis alcalino (200mM NaOH) para liberar el ADN plasmídico de las células huésped de E. coli.

El tampón de neutralización (acetato de potasio 3,0 M, pH 5,0) neutraliza el lisado resultante y crea las condiciones adecuadas para la unión del ADN plasmídico a la columna de membrana de sílice. La proteína precipitada, el ADN genómico y los restos celulares se separan mediante un paso de centrifugación y el sobrenadante se carga en una columna.

La contaminación, como las sales, los metabolitos y los componentes celulares macromoleculares solubles, se elimina mediante un simple lavado con tampón de lavado etanólico (1,0 M NaCl, 50mM MOPS, pH 7,0, isopropanol (v/v) 15 %).

El ADN plasmídico puro se eluye finalmente en condiciones de baja fuerza iónica con un tampón ligeramente alcalino (5 mM Tris / HCl, pH 8,5).

Medios de comunicación

El rendimiento y la calidad del ADN plasmídico dependen en gran medida del tipo de medio de cultivo utilizado. La mayoría de las purificaciones de plásmidos se optimizan con cultivos realizados en el medio estándar Luria Bertani (LB).

Para la preparación del medio LB, disuelva 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura y 10 g de NaCl en 800 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 7,0 con NaOH 1 N. Ajustar el volumen a 1 litro añadiendo agua destilada y esterilizar en autoclave.

El cultivo celular debe incubarse a 37 °C con agitación constante (200-250 rpm) preferiblemente de 12 a 16 horas durante la noche. Por lo general, se puede alcanzar una DO de 3-6. Como alternativa, se pueden utilizar medios ricos como 2 x YT (levadura/triptona), TB (caldo terrorífico) o CircleGrow.

También hay que tener cuidado, ya que el crecimiento excesivo de un cultivo puede conducir a un mayor porcentaje de células muertas o hambrientas y el ADN plasmídico resultante podría estar parcialmente degradado o contaminado con ADN cromosómico. Para encontrar las condiciones óptimas de cultivo, hay que optimizar el medio de cultivo y los tiempos de incubación para cada combinación de cepa huésped/construcción plasmídica de forma individual.

Lisado y neutralización

Las fórmulas de lisis pueden variar dependiendo de si se quiere extraer ADN/ARN/plásmido. Todos los métodos de lisis de bacterias producirán soluciones de plásmidos contaminadas con ADN cromosómico y ARN. La centrifugación elimina la gran mayoría del ADN cromosómico (formará un pellet, mientras que el ADN plasmídico permanece soluble), y el tratamiento con RNasa eliminará el ARN contaminante.

En general, los tampones de lisis contienen una alta concentración de sales caotrópicas. Los caótropos tienen dos funciones importantes en la extracción de ácidos nucleicos. En primer lugar, desestabilizan los enlaces de hidrógeno, las fuerzas de Van der Waals y las interacciones hidrofóbicas, lo que conduce a la desestabilización de las proteínas, incluidas las nucleasas. En segundo lugar, interrumpen la asociación de los ácidos nucleicos con el agua, proporcionando así condiciones óptimas para su transferencia a la sílice.

La separación y eliminación de los plásmidos de la célula bacteriana se realiza mediante la resuspensión de 1-5 mL de cultivo en un tampón de resuspensión (50mM Tris-Cl, 10 mM EDTA, 100 µg/ ml de RNasa A, pH 8,0) y se pelletean las células en una microcentrífuga a 11000 x g durante 30 s.

El lisado se consigue añadiendo 250 µl de tampón de lisis con tampón de neutralización, ya que ayuda a la precipitación completa del SDS, las proteínas y el ADN genómico. Una neutralización incompleta conduce a una reducción del rendimiento. Sin embargo, el ADN plasmídico liberado es muy vulnerable en este punto y agitarlo demasiado o con demasiada fuerza dañará el ADN.

Fijación y lavado en la membrana de sílice

Después de centrifugar el lisado a través de la membrana de sílice, los ácidos nucleicos deseados deberían estar unidos a la columna y las impurezas, como las proteínas y los polisacáridos, deberían estar en el flujo.

En el caso de las muestras de plantas, es probable que contengan polisacáridos y pigmentos, mientras que en el caso de las muestras de sangre, la membrana puede tener un color ligeramente marrón o amarillo. Los pasos de lavado eliminarán estas impurezas. Normalmente hay dos pasos de lavado, aunque varía según el tipo de muestra.

El primer lavado suele incluir una baja concentración de sales caotrópicas para eliminar las proteínas y pigmentos residuales. A continuación, siempre se realiza un lavado con etanol para eliminar las sales. Las columnas contienen una resina de sílice que se une selectivamente al ADN/ARN. El ADN de interés puede ser aislado en virtud de su capacidad para unirse a la sílice en presencia de altas concentraciones de sales caotrópicas. Estas sales se eliminan con un lavado a base de alcohol y el ADN se eluye utilizando una solución de baja fuerza iónica como el tampón TE o el agua.

La unión del ADN a la sílice parece estar impulsada por la deshidratación y la formación de enlaces de hidrógeno, que compiten contra la débil repulsión electrostática. Por lo tanto, una alta concentración de sal ayudará a impulsar la adsorción del ADN en la sílice, y una baja concentración liberará el ADN.

Elución

El volumen del tampón de elución y el método pueden adaptarse a la aplicación posterior para lograr un mayor rendimiento y/o concentración que el método estándar. El tampón de elución se utiliza para lavar las proteínas no unidas al principio y, a una mayor concentración, libera la proteína deseada del ligando. Es importante que el tampón de elución actúe rápidamente sin cambiar la función o la actividad de la proteína deseada. Para una elución máxima del ADN, deje que el tampón repose en la membrana durante unos minutos antes de la centrifugación. El tampón de elución AE (5 mM Tris/HCl, pH 8,5) puede sustituirse por el tampón TE o por agua. Es preferible utilizar un tampón débilmente tamponado y ligeramente alcalino que no contenga EDTA, especialmente si el ADN del plásmido está destinado a reacciones de secuenciación.

Análisis analítico del gel

Se recomienda retirar y guardar alícuotas durante el procedimiento de purificación.

Si el ADN plasmídico es de bajo rendimiento o de baja calidad, las muestras pueden analizarse mediante electroforesis en gel de agarosa para determinar en qué fase del procedimiento de purificación se produjo el problema.

Procedimiento

Harvest Bacterial and Resuspended Cells

1. Elija una sola colonia de una placa selectiva recién extendida e inocule un cultivo inicial de 2-5 ml de medio LB que contenga el antibiótico selectivo apropiado. Incubar durante aproximadamente 8 horas a 37°C con agitación vigorosa (aproximadamente 300 rpm).

2. Diluir el cultivo iniciador de 1/500 a 1/1000 en 3 ml de medio LB selectivo. Cultivar a 37°C durante 12-16 h con agitación vigorosa (aprox. 300 rpm).

3. Recoger las células bacterianas por centrifugación a 6000 x g durante 15 minutos y eliminar la mayor cantidad posible de sobrenadante. Resuspender el pellet bacteriano en 0,1-0,5 ml de tampón de resuspensión (50mM Tris-Cl, 10 mM EDTA, 100 µg/ ml de RNasa A, pH 8,0). Las bacterias deben resuspenderse completamente mediante vórtex o pipeteando hacia arriba y hacia abajo hasta que no queden grumos celulares.

Lisis celular

4. Añadir 0,25 ml de tampón de lisis, mezclar bien invirtiendo enérgicamente el tubo sellado 4-6 veces, e incubar a temperatura ambiente (15-25°C) durante 5 minutos. No agitar en vórtex, ya que esto provocaría el cizallamiento del ADN genómico. El lisado debe tener un aspecto viscoso. No deje que la reacción de lisis dure más de 5 minutos.

Neutralización

5. Añadir 0,3 ml de tampón de neutralización, mezclar inmediatamente y a fondo invirtiendo enérgicamente 4-6 veces, e incubar en hielo durante 5 minutos. La precipitación se ve reforzada si se utiliza un tampón de neutralización frío y se incuba en hielo. Tras añadir el tampón de neutralización, se forma un material blanco y esponjoso y el lisado se vuelve menos viscoso. El material precipitado contiene ADN genómico, proteínas, restos celulares y KDS. El lisado debe mezclarse a fondo para asegurar una precipitación uniforme del dodecil sulfato de potasio. Si la mezcla sigue pareciendo viscosa, es necesario mezclar más para neutralizar completamente la solución. Una suspensión homogénea e incolora indica que el SDS ha sido efectivamente precipitado.

Cargar el lisado en la columna

6. Antes de cargar la columna, retire con cuidado el sobrenadante y transfiéralo a un tubo de recogida que contenga la columna y centrifugue a 13.000 rpm durante 1 minuto.
7. Deseche el líquido de flujo y elimine rápidamente el sobrenadante que contiene el ADN del plásmido. Tras el centrifugado, el sobrenadante debe ser claro.
8. Si el sobrenadante no es claro, debe realizarse una segunda centrifugación más corta para evitar la aplicación de material suspendido o particulado a la columna. El material en suspensión (que hace que la muestra parezca turbia) obstruirá la columna y reducirá o eliminará el flujo.

Encuadernar y lavar

9. Añadir 0,7 ml de tampón de lavado a la columna colocada en el tubo de recogida y centrifugar durante 10 minutos a 13000 rpm durante 1 minuto. Equilibrar aplicando 1 ml de tampón de equilibrio ( 750 mM NaCl, 50 Mm MOPS, ph 7.0, 15 % isopropanol ) y dejar que la columna se vacíe por flujo de gravedad. El flujo del tampón comenzará automáticamente por la reducción de la tensión superficial debido a la presencia de detergente en el tampón de equilibrio.
10. Aplique el sobrenadante del paso 6 a la columna y deje que entre en la resina por flujo de gravedad.

Elución del plásmido

11. Eluir el ADN con 0,8 ml de tampón de elución (1,23 M de NAcL, 50 mm de Tris-Cl, pH 8,5, 15%v de isopropanol) Recoger el eluido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml o 2 ml.
12. Precipitar el ADN añadiendo 0,7 volúmenes (0,56 ml por 0,8 ml de volumen de elución) de isopropanol a temperatura ambiente al ADN eluido. Mezclar y centrifugar inmediatamente a ≥10.000 rpm durante 30 min en una microcentrífuga. Decantar cuidadosamente el sobrenadante. Todas las soluciones deben estar a temperatura ambiente para minimizar la precipitación de sales.
13. Lavar el pellet de ADN con 1 ml de etanol al 70% y centrifugar a 10.000 rpm durante 10 min.
14. Decantar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el pellet.
15. El etanol al 70% elimina la sal precipitada y sustituye el isopropanol por el etanol, más volátil, lo que facilita la redisolución del ADN.
16. Seque el pellet al aire durante 5-10 minutos y vuelva a disolver el ADN en un volumen adecuado de tampón (por ejemplo, tampón TE, pH 8,0, o Tris-Cl 10mM, pH 8,5). Vuelva a disolver el pellet de ADN enjuagando las paredes para recuperar todo el ADN.

Determinación del rendimiento

Para determinar el rendimiento, la concentración de ADN debe determinarse tanto por espectrofotometría UV a 260 nm como por análisis cuantitativo en un gel de agarosa. Para cuantificar la concentración de ácido nucleico, diluir el ADN plasmídico 1 : 100 o 1 : 50 (dependiendo del número de copias del plásmido) en tampón TE y medir la absorbancia (densidad óptica) a 260 nm (A260) y 280 nm (A280). Utilizar el tampón TE como blanco. Esta medición permite el cálculo directo de la concentración de ácido nucleico mediante la fórmula

[ADN] (μg/mL) = A260 × Factor de dilución × 50

donde 50 es el coeficiente de extinción del ADN. La relación A260/A280 proporciona una estimación razonable de la pureza de la preparación.