El Western blot (inmunoblot) o electrotransferencia, es una técnica analítica usada en biología celular y molecular para identificar proteínas específicas en una mezcla compleja de proteínas, tal como la que se presenta en extractos celulares o de tejidos. La técnica utiliza tres etapas para lograr esto: separación por tamaño, transferencia a un soporte sólido y, finalmente, visualización mediante la marcación de proteínas con el uso de anticuerpos primarios o secundarios apropiados.

Western blot es una técnica de laboratorio utilizado para detectar una proteína específica en una muestra de sangre o tejido. El método implica el uso de electroforesis en gel para separar las proteínas de la muestra. Las proteínas separadas se transfieren del gel a la superficie de una membrana. La membrana se expone a un anticuerpo específico contra la proteína en estudio. La unión del anticuerpo se detecta usando un marcador radiactivo o químico. Un Western Blot se utiliza a veces para diagnosticar enfermedades.

El Western Blotting (también llamado immunoblotting) es una técnica utilizada para el análisis de proteínas individuales en una mezcla de proteínas (por ejemplo, un lisado celular).

En el Western blot(inmunoblot) la mezcla de proteínas se aplica a una electroforesis en gel en una matriz portadora (SDS-PAGE, PAGE nativa, enfoque isoeléctrico, electroforesis en gel 2D, etc.) para clasificar las proteínas por tamaño, carga u otras diferencias en las bandas de proteínas individuales.

A continuación, las bandas de proteínas separadas se transfieren a una membrana portadora (por ejemplo, nitrocelulosa, nylon o PVDF). Este proceso se denomina blotting. Las proteínas se adhieren a la membrana en el mismo patrón en el que han sido separadas debido a las interacciones de cargas.

Las proteínas de este inmunoblot son entonces accesibles para la unión de anticuerpos para su detección.

Los anticuerpos se utilizan para detectar las proteínas objetivo en el western blot (inmunoblot). Los anticuerpos se conjugan con etiquetas fluorescentes o radiactivas o con enzimas que dan lugar a una reacción posterior con un reactivo aplicado, lo que da lugar a una coloración o emisión de luz que permite la detección.

El término Western Blotting se basa en un juego de palabras. El southern blot, que es un método para detectar secuencias específicas de ADN, debe su nombre a Ed Southern, que fue el primero en describir este procedimiento.

El western blot (inmunoblot), así como el northern blot (para la detección de ARN), juegan con el significado de este nombre.

La electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar fragmentos de ADN (u otras macromoléculas, como ARN y proteínas) por su tamaño y carga. La electroforesis consiste en aplicar una corriente a través de un gel que contiene las moléculas de interés. Con base en su tamaño y carga, las moléculas se desplazarán por el gel en diferentes direcciones o a distintas velocidades, con lo que se separan unas de otras.

• La electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar fragmentos de ADN según su tamaño.
• Las muestras de ADN se cargan en pozos (ranuras) en un extremo de un gel y se aplica una corriente eléctrica para arrastrarlas a través del gel.
• Los fragmentos tienen carga negativa, por lo que se mueven hacia el electrodo positivo. Puesto que todos los fragmentos de ADN tienen la misma cantidad de carga por masa, los fragmentos pequeños atraviesan el gel más rápido que los grandes.
• Cuando un gel se tiñe con un pigmento que se une al ADN, los fragmentos de ADN pueden verse como bandas, las cuales representan un grupo de fragmentos de ADN del mismo tamaño.

Se puede elegir entre diferentes tipos de electroforesis en gel para las proteínas en función de los criterios por los que se deben separar las proteínas. Algunos métodos electroforéticos comúnmente utilizados son: SDS-PAGE, native-PAGE y enfoque isoeléctrico.

Se trata de un método desnaturalizante, ya que trata las proteínas con un detergente aniónico SDS (dodilsulfato de sodio). La estructura secundaria y terciaria se destruye con este proceso. Además, el SDS se adhiere a las proteínas y, por tanto, cubre sus cargas químicas, lo que hace que las proteínas tengan una carga igualmente negativa.

Por tanto, la siguiente separación se produce únicamente por el tamaño de las cadenas polipeptídicas en el gel de poliacrilamida.

Con este método se pueden separar proteínas nativas, no plegadas y no desnaturalizadas. Este método permite la separación de proteínas que son inaccesibles por otros métodos. Un ejemplo sería la separación de proteínas modificadas y no modificadas del mismo tipo (por ejemplo, el estado fosforilado frente al no fosforilado de una proteína). La PAGE nativa también puede utilizarse para confirmar conformaciones biológicamente relevantes, como las formas di-, tri- o tetraméricas de las proteínas (al contrario que la SDS-PAGE, que separaría las cadenas peptídicas individuales y desnaturalizadas). Este método también puede detectar diferentes complejos de distintas proteínas.

La separación mediante “Nativo PAGE” depende de una serie de parámetros como la carga, el tamaño y la estructura 3D de la proteína. Se necesita un tampón adecuado para mantener el plegado 3D de la proteína. La aplicabilidad del tampón depende del punto isoeléctrico y de las cargas de la proteína.

Este método se basa en el hecho de que una proteína tiene una carga específica a determinados valores de pH. Dependiendo del pH, los grupos funcionales ácidos y básicos contribuyen a aumentar o disminuir la carga total de la proteína. El punto isoeléctrico se define como el punto en el que la carga total de la molécula es cero, porque hay una cantidad igual de cargas negativas y positivas en la molécula.

Se necesitan geles de gradiente especiales para el enfoque isoeléctrico, ya que el pH cambia de ácido a básico a lo largo de un gradiente dentro del gel. Debido a una carga eléctrica conectada al gel, la proteína se desplaza hasta el punto del gel en el que la carga del gel es igual a la de la proteína, y la carga total es igual a cero, es decir, el punto isoeléctrico. Por lo tanto, este método se utiliza para separar las proteínas por sus cargas, así como para determinar el punto isoeléctrico de una proteína objetivo. La separación se produce por la carga de la proteína o por el número de grupos básicos y ácidos que contiene la proteína.

Los métodos mencionados para la electroforesis en gel de las proteínas también pueden combinarse para separar las proteínas. La elección de los métodos depende de los requisitos específicos del experimento.

Tras la separación de la mezcla de proteínas, las bandas de polipéptidos se transfieren a un soporte de membrana. Para ello, la membrana se adhiere al gel y este llamado sándwich se transfiere a una cámara de electroforesis. Es posible que una parte del SDS se elimine y que la proteína vuelva a saturarse parcialmente, es decir, que recupere su estructura 2D y 3D. Sin embargo, la carga eléctrica aplicada hace que las proteínas se desplacen fuera del gel verticalmente en la dirección en la que se desplazaron en el gel, sobre la membrana. De este modo, las bandas de proteínas se unen a la membrana. Las bandas “borradas” están ahora disponibles para ser tratadas posteriormente (por ejemplo, para la detección de proteínas específicas con anticuerpos específicos).

La identificación de anticuerpos específicos es posible tras la separación y el “blotting” de las proteínas. Los anticuerpos específicos (monoclonales o policlonales) se unen a “su” banda de proteínas. Los anticuerpos de unión inespecífica se eliminan mediante el lavado con tampones que contienen detergentes. Además, las bolsas de unión inespecífica pueden bloquearse antes de añadir los anticuerpos específicos.

Por lo general, se aplican primero los anticuerpos primarios, que luego son reconocidos por un anticuerpo secundario. El anticuerpo secundario se conjuga con color, radiactividad o una enzima para su detección. También se utilizan anticuerpos conjugados con biotina para este fin.

El método western blot (inmunoblot) conlleva varias ventajas en comparación con otros ensayos de inmunoabsorción (ISA), como por ejemplo ELISA.

El western blotting (immunoblot) amplía la idea del ELISA al permitir la separación de la mezcla de proteínas por tamaño, carga y/o conformación. El método de stripping descrito permite la detección de varias dianas, al contrario que el ELISA, en el que sólo se puede detectar una proteína.

Como la electoforesis en gel de las proteínas separa las proteínas en bandas, se puede determinar el tamaño de la proteína/polipéptido objetivo. También es posible (semi)cuantificar la proteína de interés ejecutando un estándar de cantidad interna en paralelo con las muestras en el gel.

Asimismo, se puede comparar el contenido proteico de las muestras (“la muestra A contiene más proteínas que la muestra B”).

Una desventaja del western blot (inmunoblot) es que requiere mucho tiempo (comparado con el ELISA) y tiene una alta demanda en términos de experiencia del experimentador.

Además, requiere la optimización de las condiciones experimentales (es decir, el aislamiento de las proteínas, los tampones, el tipo de separación, la concentración del gel, etc.).

Hay muchos tipos y métodos diferentes de western blotting (inmunoblot). Por lo tanto, abarca temas y aplicaciones muy diferentes.

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Las características del “Mouse IFN-beta ELISA”

• Los emparejamientos optimizados de anticuerpos de captura y detección con las concentraciones recomendadas ahorran mucho tiempo de desarrollo
• Se proporcionan protocolos de desarrollo para guiar la optimización del ensayo
• El ensayo puede adaptarse a sus necesidades específicas
• Alternativa económica a los kits completos

SOCS1 es un miembro de la familia de los inhibidores de STAT (SSI), también conocidos como supresores de la señalización de citoquinas (SOCS). Los miembros de la familia SSI son reguladores negativos de la señalización de citoquinas. SOCS1 funciona a la salida de los receptores de citoquinas y participa en un bucle de retroalimentación negativa para atenuar la señalización de las citoquinas.

Los anticuerpos policlonales se producen inmunizando a los animales con un péptido sintético correspondiente a los residuos que rodean a Ala156 de SOCS1 humana. Los anticuerpos se purificaron mediante cromatografía de afinidad de proteínas A y péptidos.

Varios proveedores ofrecen antibodies anti-SLC1A5. Este gen codifica la proteína “solute carrier family 1 member 5” en humanos y también puede ser conocido como ASCT2, AAAT, ATBO, M7V1, neutral amino acid transporter B(0), y ATB(0). Estructuralmente, la proteína tiene una masa de 56,6 kilodaltons. Basándose en el nombre del gen, también se pueden encontrar ortólogos caninos, porcinos, de mono, de ratón y de rata.