Los métodos de blotting se consideran una ayuda para la electroforesis en gel, que se aplica generalmente para la separación de ADN/ARN/proteínas y produce resultados reproducibles gracias a su excelente poder de resolución.
De este modo, se pueden detectar moléculas específicas en medio de la combinación de moléculas que se someten a la separación. La mayoría de los métodos tienen un paso general en el que las moléculas de interés, una vez separadas, se transfieren desde el gel a una fase de membrana sólida, lo que se consigue empapando una solución a través del gel y la membrana mediante papel penetrable. Muchos tipos de aparatos multifacéticos son también proporcionados por muchos proveedores para el electroblotting que es más específicamente útil para la transferencia iniciada desde geles de poliacrilamida menos porosos en comparación con los geles de agarosa porosos comúnmente utilizados. En el caso del ADN y el ARN, la detección de secuencias específicas en la membrana se lleva a cabo mediante la hibridación con sondas marcadas con ácidos nucleicos, que en el caso de las proteínas se sustituye por el uso de sondas marcadas con anticuerpos.
Los protocolos desarrollados inicialmente aplicaban sondas radiactivas marcadas con, isótopos radiactivos para su detección mediante la aplicación de procedimientos de autorradiografía. En este proceso se utiliza el patrón de emisiones de desintegración radiada de un material radiactivo para producir una imagen en una película de rayos X que también puede estar disponible como imagen digital mediante la aplicación de detectores de gas basados en el centelleo o sistemas basados en la fosforización.
Teniendo en cuenta los efectos nocivos de la exposición a la radiactividad, se han desarrollado otros tipos de sistemas de etiquetado que incluyen reactivos fluorescentes y quimioluminiscentes. Los métodos basados en la luminiscencia/fluorescencia se consideran sensibles y libres de fondo, por lo que generan resultados más precisos.
Además, se han introducido otras modificaciones en contraste con el método original, como la aplicación de sondas de ADN en lugar de ARN, las membranas de nailon han sustituido a la tradicional nitrocelulosa y, para evitar la renaturalización de las secuencias de ADN durante la transferencia, ésta se lleva a cabo en una solución alcalina, mientras que en el protocolo original debía realizarse en una solución neutra. El ADN se somete a un tratamiento ácido para reducir su tamaño con el fin de aumentar la velocidad de transferencia de los fragmentos más grandes.
Ya no se utilizan las tiras de gel y los geles de tubo aplicados en el protocolo original, sino que se aplican formatos de gel. Aunque ha habido muchos cambios en el protocolo original, los protocolos actuales mantienen la mayoría de las características fundamentales del protocolo original.
El Southern blotting se aplicó en muchos estudios importantes, como el mapeo genético del genoma humano, que se basó en la detección de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción mediante blotting.
También se desarrolló por primera vez la huella de ADN mediante la hibridación de los productos de digestión de restricción del ADN humano con sondas de minisatélites. Sin embargo, la mayor parte de las aplicaciones primarias de este método han sido sustituidas ahora por la secuenciación del ADN y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ya que proporcionan hechos o datos más amplios y, además, son fáciles de aplicar.
No obstante, el blotting se sigue aplicando en muchos ámbitos, como la medición del número de copias, el análisis de tramos largos de ADN que son difíciles de amplificar o secuenciar mediante la PCR o la secuenciación del ADN, y en el caso del análisis estructural del ADN, en el que las formas físicas del ADN se separan mediante electroforesis en gel bidimensional y, posteriormente, se detectan mediante blotting de componentes específicos.
Homogeneización de la muestra que implica la purificación del ADN/ARN/proteínas que se realiza después de la extracción de una variedad de fuentes como células o tejidos.
Digerir el ADN con enzimas de restricción en fragmentos, lo que no es necesario para el ARN (northern blot).
Separación de la molécula de interés mediante una membrana de electroforesis generalmente en un gel de agarosa para los fragmentos de ADN. En el caso de las muestras de ARN se pueden separar en un gel de agarosa en presencia de formaldehído como agente desnaturalizador. Esto es necesario porque el formaldehído confina las estructuras secundarias de las moléculas de ARN.
Transferir las moléculas (fragmentos de ADN/ARN) a una membrana nitrocelulósica/membrana de nylon desde el gel.
Prehibridación (bloqueo): El lavado de la membrana de nylon con una solución de prehibridación o bloqueo que incluya ADN de esperma de salmón es necesario para bloquear las interacciones no específicas del ADN y también ayuda a reducir el ruido de fondo. Como alternativa, hay algunos tampones de bloqueo disponibles en el mercado, como el tampón PerfectHyb™ Plus, en el que no se requiere ADN de salmón para el bloqueo.
Para la preparación de la sonda se prepara ADN fresco marcado con dCTP marcado con 32P alfa.
Hibridación o identificación de la molécula que se consigue incubando el blot con la sonda específica marcada.
Para la detección de la sonda y de la secuencia de ADN/ARN de interés se expone la película a -80°C.
La primera de estas técnicas desarrolladas fue el Southern blot, llamado así por el Dr. Edwin Southern, que lo desarrolló para identificar secuencias específicas de ADN. El Southern blot es una técnica de detección utilizada para encontrar las secuencias de ADN objetivo en la muestra de ADN en el campo de la biología molecular.
El proceso parte de la electroforesis de moléculas de ADN que se hibridan en una membrana de blotting, seguida de un paso de transferencia en el que el ADN del gel se transfiere a la membrana de blotting.
La capacidad de hibridación de las cadenas de ADN proviene de su naturaleza complementaria, claramente representada en el modelo de estructura del ADN de Watson-Crick. Al principio se realizaron experimentos para estudiar la capacidad de renaturalización del ADN y la formación de híbridos de ADN/ARN para comprender la expresión específica de los tejidos o las células.
Posteriormente, la hibridación entró en escena con el desarrollo de sondas capaces de detectar secuencias específicas dentro de la diana y la inmovilización de las secuencias diana en un soporte sólido como el polvo de nitrocelulosa, que posteriormente dio lugar a las membranas de nitrocelulosa.
La demostración por parte de Southern de que los fragmentos de ADN separados por electroforesis en gel pueden transferirse a una membrana permitió la caracterización del ADN por el patrón de hibridación y por sus tamaños moleculares. Más tarde, este método se aplicó para la identificación espacial de objetivos y el blotting de colonias bacterianas.
La etapa de electroforesis puede realizarse utilizando dos tipos diferentes de geles, como el gel de poliacrilamida (PAGE) con urea y el de dodecil sulfato de sodio (SDS) con urea. Estos dos geles tienen una aplicación diferente. Cuando se utiliza un gel PAGE, se transfiere la misma cantidad de fragmentos de ADN al papel secante. Si se utiliza un SDS la resolución de la banda formada sigue siendo la misma.
En esta técnica se pueden identificar moléculas de ADN de tamaño, 100 pg. La técnica se puede resumir como la formación de ADN de doble cadena que tiene una hebra del ADN objetivo y la otra de la sonda de ADN. La sonda de ADN se produce in vitro para la secuencia de interés.
La endonucleasa de restricción, que es una enzima, se utiliza para romper el ADN en pequeños fragmentos. A continuación, estos fragmentos se separan mediante electroforesis. Los fragmentos conseguidos se clasifican entonces según su tamaño (kDa). Así, los fragmentos de ADN se transfieren al papel de blot donde se incuba con sondas.
Las sondas utilizadas en el Southern blotting pueden ser altamente selectivas. Pueden unirse selectivamente con una resolución de 1 en un millón y las características para unirse a los fragmentos objetivo previstos.
A continuación hablaremos sobre Southern blot pasos que debes seguir para detectar una secuencia específica de ADN en una muestra de sangre o tejido.
Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. Las posibles fuentes de ADN en la escena de un delito incluyen sangre, semen, tejido de una víctima muerta, células del folículo capilar y saliva. El ADN extraído de las pruebas del delito (“indicios” o “vestigios” biológicos) se compara con el extraído de muestras de referencia, obtenidas de personas conocidas, habitualmente de la sangre.
El ADN extraído de la muestra se trata con una endonucleasa de restricción, que es una enzima que corta el ADN bicatenario en donde tenga una secuencia característica. La enzima que se usa más frecuentemente para el análisis legal es HaeIII, que corta el ADN en la secuencia 5′-GGCC-3′.
Tras la digestión del ADN, los fragmentos de ADN resultantes se separan según su tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa. Durante la electroforesis, las moléculas de ADN, que poseen carga negativa, migran hacia el electrodo positivo.
Al avanzar las moléculas de ADN, su velocidad de migración se ve reducida por la matriz del gel de agarosa. Las moléculas menores se mueven más deprisa a través de los poros del gel que las de mayor tamaño.
Como resultado, se produce una separación continua de los fragmentos de ADN de acuerdo con su tamaño, de modo que los fragmentos más pequeños avanzan la mayor distancia con referencia al origen o punto de aplicación de la muestra.
Tras la electroforesis, las moléculas de ADN separadas se desnaturalizan mientras permanecen en el gel de agarosa, impregnando éste con una disolución alcalina. Tras la neutralización de esta, el DNA monocatenario resultante se transfiere a la superficie de una membrana de nailon, realizando así una copia o “calco” (la traducción más literal del inglés blot, conservando este sentido, es “secante”).
Este proceso de desnaturalización y transferencia se conoce como método de Southern en recuerdo de quien lo inventó, Edward Southern. Al igual que la aplicación de un secante a un papel con la tinta húmeda transfiere una réplica de la imagen del papel al secante, el “calco” del ADN en el gel a la membrana de nailon conserva la distribución espacial de los fragmentos de ADN conseguida en el gel como resultado de la electroforesis.
Una sonda de locus único es una molécula pequeña de ADN o ARN capaz de hibridar (es decir, de formar un dúplex ADN-ADN o ADN-ARN) con el ADN de un fragmento de restricción concreto en el ensayo de Southern.
La formación de la molécula dicatenaria (dúplex) depende del emparejamiento de bases complementarias entre las secuencias de la sonda y del ADN presente en el “calco”. Las sondas de locus único se marcan habitualmente con un isótopo radiactivo para facilitar su detección, y se eligen para que detecten un locus genético polimórfico en un solo cromosoma humano.
El ensayo de Southern resultante de la etapa 4 se incuba en una disolución que contiene una sonda radiactiva de locus único, bajo condiciones de temperatura y concentración de sales que favorezcan la hibridación. Tras producirse esta, se lava el exceso de sonda no unido, de modo que la única radiactividad que quede en la membrana de nailon sea la asociada al ADN del locus diana.
Las posiciones de hibridación de la sonda radiactiva sobre la membrana del ensayo de Southern se detectan mediante autorradiografía. En esta técnica, la membrana de nailon se coloca, una vez lavada, junto a una película de rayos X dentro de una caja que las aísle de la luz. La película registra las posiciones donde hay desintegración radiactiva. Tras su exposición y el revelado fotográfico, el registro resultante de la hibridación de Southern se conoce como autorradiografía
En un análisis legal de DNA se suelen caracterizar polimorfismos de ADN en varios cromosomas diferentes. Tras el revelado de una autorradiografía para la primera sonda, se puede lavar la radiactividad con una disolución a elevada temperatura, que deja el ADN en su sitio, e hibridarlo con una segunda sonda radiactiva que se una a un locus diferente. Se repiten así las etapas 5-7, detectando cada vez un locus diferente. El grupo de autorradiografías de una misma transferencia de Southern se conoce como un “perfil de ADN”
