Cultivo y mantenimiento de células madre

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Las células madre, procedentes de donantes sanos o de pacientes, se utilizan a menudo en la investigación básica, el descubrimiento de fármacos y las aplicaciones terapéuticas, pero su cultivo puede resultar difícil. Este artículo ofrece consejos sobre cómo cultivar células madre en el laboratorio para garantizar resultados reproducibles y fiables.

En las condiciones adecuadas, las células madre mantienen su estado de células madre (autorrenovación) o se diferencian a lo largo de una vía específica. Estas células proceden de fuentes que van desde el embrión hasta el tejido conectivo, o pueden crearse mediante la desdiferenciación de linajes ya comprometidos.

A efectos prácticos, la mayoría de las células madre pueden dividirse en dos tipos: células madre adultas y células madre pluripotentes (CMP), señala James Chen, director general de ScienCell. Esta última categoría incluye las células madre embrionarias (ESC) y las células madre pluripotentes inducidas (iPSC). “Estas células utilizan básicamente las mismas condiciones de cultivo”, explica Chen.

Feed me : Cultivo de células madre

“El cultivo de células madre es un arte, y todavía estamos en nuestra infancia”, señala Lindy O’Clair, Directora de Reactivos y Consumibles de BioAnalytics, Gestión de Productos de BioAnalytics Workflows, Sartorius. “Es importante tener en cuenta la calidad del material de partida. La comprensión de los reactivos y su impacto en la viabilidad y reproducibilidad de los cultivos celulares, así como el cultivo en equipos fiables, permite obtener datos fiables y reproducibles.”

Históricamente, las PSC se cultivaban sobre una capa de células alimentadoras, normalmente fibroblastos inactivados mitóticamente, una técnica que se sigue utilizando hoy en día. Estas células alimentadoras no sólo proporcionaban una matriz de soporte físico, sino que también condicionaban el medio de cultivo con factores de crecimiento (a veces no identificados) necesarios para el desarrollo de las células madre y su mantenimiento en estado indiferenciado. Además de los problemas de reproducibilidad, el sistema de células alimentadoras tiene algunas desventajas, como el hecho de que requiere mucha mano de obra y que la superficie de alimentación debe prepararse de antemano. Puede dar lugar a cultivos mixtos que pueden ser difíciles de separar. Además, en el caso de la alimentación entre especies (fibroblastos de ratón con PSC humanas, por ejemplo), existe el riesgo de transmisión de patógenos.

Los cultivos sin alimentación son más fáciles de preparar y mantener, requieren menos tiempo, son más reproducibles, se pueden escalar más fácilmente y no sufren los posibles inconvenientes de los cocultivos.

Sin embargo, en ausencia de una capa de células alimentadoras, las PSC no se adhieren a las superficies comunes de cultivo de tejidos. Una amplia gama de matrices, normalmente derivadas de proteínas de la matriz extracelular (ECM) o que las imitan, solas o combinadas, se utilizan como soportes físicos, tanto para cultivos (relativamente) planos como para cultivos más tridimensionales. Los investigadores pueden recubrir ellos mismos las placas de cultivo utilizando la matriz de su elección a la dilución deseada, dependiendo del protocolo que estén siguiendo, o comprar placas de cultivo ya recubiertas.

En ausencia de células alimentadoras, el medio condicionado se ha sustituido por un medio de células madre definido, basado en el trabajo pionero de James Thomson, de la Universidad de Wisconsin. Varias empresas ofrecen ahora medios comerciales similares para el cultivo de CPS, explica Chen: Son básicamente DMEM/F12 y suplementos”, siendo el principal suplemento el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF).

Cultivo de iPSC

Aunque hay algunos proveedores selectos de los que se pueden obtener iPSC, la mayoría de la gente aísla las suyas propias; hay muchos protocolos buenos que se pueden obtener de colegas y en línea, comenta Chen.

Las líneas celulares resultantes pueden variar entre sí dependiendo de una serie de factores, según la guía del ATCC sobre el cultivo de células madre: Consejos y técnicas para el cultivo de células madre. Entre ellos se encuentran la genética, la huella genómica y las condiciones de cultivo, así como el método utilizado para desdiferenciar (reprogramar) las células a un estado pluripotente.

Pero existen métodos casi universales para el cuidado de las CPS.

Algunos consejos

Los cultivos deben examinarse diariamente. En particular, hay que estar atento a los cambios morfológicos, que pueden significar que las células se están diferenciando – menos del 10% de las células deberían diferenciarse. Las PSC no diferenciadas se desarrollan como colonias compactas, con una elevada relación núcleo/citoplasma y núcleos prominentes. Las pequeñas colonias pueden parecer inicialmente sueltas, pero se van apretando a medida que crecen. Como las colonias tienden a apilarse y superponerse a medida que crecen, sus centros tienden a aparecer brillantes.

Las células que muestren signos de diferenciación y las que no estén adheridas deben eliminarse; una buena forma de hacerlo es marcar la zona y aspirarlas con una punta de 200 microlitros en el extremo de una pipeta de aspiración.

El medio debe cambiarse por completo cada día o cada dos días (dependiendo de a quién se pregunte).

Controle la confluencia. Las células deben transferirse cuando alcancen un 80% de confluencia o después de unos cinco días. Manipule los cultivos con cuidado, utilizando un método libre de enzimas (con un agente quelante como EDTA o EGTA) o una solución enzimática suave como Accutase para retirar las células de la placa. Asegúrese de que las células permanezcan agrupadas (menos propensas a diferenciarse) y minimice el pipeteo de las células durante el paso. El inhibidor de ROCK debe utilizarse cuando las células se están recuperando del pasaje o de la descongelación (pero no es necesario durante los simples cambios de medio).

Durante el pasaje, las células deben dividirse en una proporción de 1:4 y congelarse en grupos utilizando un medio de congelación de células madre en frío a una velocidad de un grado por minuto.

Conozca lo que tiene

La morfología puede variar según las condiciones de cultivo y el estado de las células. Muchos investigadores confían en los paneles de marcadores de pluripotencia para comprobar el estado de sus células, señala O’Clair, un proceso largo y caro que requiere el sacrificio de células (los ensayos funcionales en los que se induce a las células madre a diferenciarse en fenotipos más comprometidos lo son aún más). Ella “espera la llegada de una tecnología que pueda identificar y evaluar con precisión el estado del cultivo de células madre”.

“Otras” células madre

Las células madre adultas -células multipotentes autorrenovables pero no comprometidas, aisladas del tejido somático- son una alternativa atractiva a las CPS, señala John Ludlow, vicepresidente de medicina regenerativa de Zen-Bio. La materia prima puede ser esencialmente ilimitada, y su cultivo suele ser mucho menos delicado -a menudo en material de cultivo tisular ordinario, utilizando medios de cultivo estándar disponibles en el mercado y factores de crecimiento contenidos en suero bovino fetal. Dependiendo de la fuente, pueden diferenciarse -parcial o totalmente- a través de vías seleccionadas en, por ejemplo, adipocitos o neurocitos, monocitos o hepatocitos.

Las células madre adultas y su progenie pueden utilizarse para generar materiales como enzimas, por ejemplo”, afirma Ludlow. Se pueden utilizar para ensayos funcionales y agonizar o antagonizar farmacológicamente para modular esa función. Pueden migrar a través de membranas o utilizarse en estudios con animales para examinar su perfil de toxicidad”.

Las células madre, de cualquier variedad -pluripotentes, adultas, incluso cancerosas, o las que aún están por descubrir-, serán inevitablemente explotadas para una multitud de aplicaciones que van desde una mejor comprensión de la biología básica, la salud y la enfermedad, hasta el alivio o la curación de enfermedades. Cultivar y mantener estas células, aunque es un arte, no es ciencia espacial.