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ADN complementario (cDNA)
El ADN complementario ( cDNA ) es un ADN de doble cadena, modelo de una molécula de ARNm. En los eucariotas superiores, un ARNm es un predictor más útil de una secuencia polipeptídica que una secuencia genómica, porque los intrones se han empalmado. Los investigadores prefieren utilizar el cDNA en lugar del propio ARNm porque los ARN son intrínsecamente menos estables que el ADN y no existen técnicas para amplificar y purificar rutinariamente moléculas individuales de ARN.
El ADN complementario se elabora a partir del ARNm con el uso de una enzima única conocida como transcriptasa opuesta, que procede por primera vez de los retrovirus. Utilizando una molécula de ARNm como plantilla, la transcriptasa inversa sintetiza una molécula de ADN monocatenario que puede utilizarse como plantilla para la síntesis de ADN bicatenario.
¿Qué es el cDNA?
El ADN complementario es una copia de ADN que puede proceder de procariotas o eucariotas. Se utiliza en ingeniería genética para suministrar clones de diferentes genes. El cDNA se sintetiza a partir del ARNm mediante una enzima llamada transcriptasa inversa.
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Síntesis de cDNA
En la vida celular, el ADN complementario se genera a través de virus y retrotransposones para la integración del ARN en el ADN genómico meta. En la biología molecular, el ARN se purifica a partir del tejido inicial tras la eliminación del ADN genómico, las proteínas y otros componentes celulares.
La síntesis de ADN complementario a partir del ARN es un primer paso vital en muchas aplicaciones moleculares. El análisis de la expresión génica, la detección de patógenos y las pruebas genéticas mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) o la secuenciación de próxima generación (NGS) son sólo algunos ejemplos de aplicaciones que requieren la transcripción del ARN en cDNA como paso inicial.
La obtención de resultados exactos y precisos con estas aplicaciones requiere una síntesis de cDNA de alta fidelidad para que la biblioteca de cDNA represente con exactitud los transcritos de ARN originales.Dos aspectos críticos a la hora de decidir un paquete de síntesis de ADNc son la enzima transcriptasa opuesta y el enfoque de cebado utilizado para provocar la reacción. La elección de la enzima influye en la velocidad de síntesis y en la fidelidad de la reacción. Las estrategias de cebado influyen en lo que se transcribe en la reacción y, si no son óptimas, pueden dar lugar a una biblioteca sesgada que no represente con exactitud todo el transcriptoma.
¿Qué es el kit de síntesis de cDNA?
Los kits de síntesis de ADNc ofrecen una forma rápida y fiable de fabricar ADNc a partir de muestras de ARN. Estos cómodos kits, listos para usar, incluyen los componentes necesarios para la transcripción inversa, la transcriptasa inversa (RT), los dNTP, el tampón de reacción, el agua libre de nucleasas y los inhibidores de RNasa. Los protocolos optimizados y los reactivos de alta calidad suministrados pueden ayudar a resolver rendimientos insatisfactorios de ADNc debido a una baja concentración de ARN, a la complejidad del gen diana o a inconsistencias en los reactivos.
Para preparar la reacción, se suele incluir oligo(dT) o hexámeros aleatorios (o ambos). Al elegir un kit de síntesis de ADNc, tenga en cuenta el tamaño del fragmento transcrito, la compatibilidad con las aplicaciones posteriores y el número de reacciones por kit.