Bloqueo de genes (gene knockout)
El bloqueo de genes (gene knockout), o también llamado inactivación de genes , es una técnica genética en la que se suprime la expresión de un gen concreto en un organismo sustituyendo el gen original en su locus genético por una versión modificada del gen en la que se han eliminado uno o más exones, lo que da lugar a organismos que no expresan el gen en un tejido concreto o en todo el organismo. Estos organismos también se denominan knockout.
Un knockout es idéntico al anterior, pero en lugar de eliminar un gen concreto, lo sustituye por una versión alterada del mismo que produce una función adicional.
Bloqueo de genes o gene knockout
Las tecnologías de bloqueo de genes se utilizan para alterar los genomas de todos los organismos vivos. Cuando una mutación inactiva la función de un gen, se denomina gene knockout. Los métodos de knockout de genes se utilizan para identificar la función de un gen concreto inhibiendo la función de ese gen.
Este proceso se utiliza tanto en la genética clásica como en técnicas modernas como la genómica funcional. Inicialmente, la eliminación de genes se realizó mediante mutagénesis de transposones. La principal desventaja de este método es el tedioso cribado para encontrar el gen neutralizado. La eliminación de otros organismos se logró con la ayuda de la ingeniería genética.
Las técnicas in vitro se utilizan para modificar genes en plásmidos o cromosomas artificiales bacterianos (BAC), y estas construcciones modificadas se transfieren después al organismo en cuestión mediante técnicas de cultivo celular. Otros métodos utilizan una combinación de ingeniería genética y recombinación homóloga in vivo. Sin embargo, esta combinación no es tan eficaz.
La recombinación homóloga es la última herramienta para producir knockouts de genes. Permite la declaración directa del cromosoma bacteriano o la modificación de cualquier plásmido o BAC in vivo como precursores. Esta técnica no depende de los sitios de restricción. Un casete de fármaco puede colocarse en cualquier lugar de un gen o la lectura abierta del gen puede ser sustituida por el casete de fármaco. En cualquier caso, se selecciona la construcción deseada.
Métodos del bloqueo de genes (gene knockout)
Existen diferentes técnicas de biología molecular para influir en la expresión de los genes. Estas técnicas difieren en los instrumentos utilizados, el tiempo necesario para obtener un resultado positivo y la especificidad del resultado. Estas técnicas incluyen:
- Recombinación homóloga: el gen original es sustituido por una versión mutada. Esta versión mutada puede eliminar casi toda la secuencia del gen o dejar la expresión de los primeros exones. Normalmente se tardan varios meses en obtener individuos modificados (especialmente en ratones), aunque tienen la ventaja de ser muy específicos: estos organismos sólo carecen del gen objetivo.
- La transgénesis, que consiste en introducir en el gen original secuencias que lo modifican para producir cambios que dan lugar a proteínas no funcionales. Se trata de una técnica generalmente más rápida, cuyo inconveniente es que el gen endógeno sigue presente y puede producir una proteína, incluso mutada, que puede afectar a otras moléculas de la vía metabólica a la que pertenece. Además, puede producirse una nueva mutación por azar y revertir la modificación introducida produciendo de nuevo la proteína original, lo que ocurre con cierta frecuencia.
- Mutagénesis. Los mutantes pueden obtenerse utilizando un producto mutagénico (por ejemplo, EMS) que produce mutaciones al azar. A continuación, se seleccionan los organismos que llevan codones “STOP” en la secuencia deseada. Se trata de un método rápido para obtener mutantes, aunque no es específico para el gen objetivo, lo que puede dar lugar a contratiempos.
- Derribo. Las secuencias de ADN que expresan moléculas de ARN interferente pueden introducirse en el genoma de un organismo o directamente en las células. Estas moléculas interfieren específicamente en la expresión del gen diana, lo que suele dar lugar a una reducción de la expresión (por esta razón también se denominan “knockdown”). Esta técnica es más rápida que la obtención de un organismo “knock-out”, pero no da lugar a la eliminación completa de la expresión, y la secuencia introducida que codifica el ARN interferente también puede sufrir mutaciones que inactiven el efecto deseado.
Tecnologías para el knock-out genético
El mejor enfoque para producir un knockout genético es la recombinación homóloga. Mediante los métodos de knockout genético, se elimina un solo gen sin afectar a todos los demás genes de un organismo. Con este método, el organismo en el que el gen en cuestión deja de ser funcional se denomina organismo knockout. Cuando se elimina más de un gen en un organismo, se denomina doble knock-out o DKO, triple knock-out o TKO y cuádruple knock-out o QKO, dependiendo del número de genes.
Métodos de ingeniería genética
La eliminación de genes se lleva a cabo con elementos como plásmidos, construcciones de ADN o cromosomas bacterianos artificiales.
El proceso de knock-out del gen suele producir animales transgénicos en los que el gen objetivo ha sido alterado. Para crear animales transgénicos, se modifican genéticamente las células madre embrionarias o células ES y en el siguiente paso las células ES transformadas se insertan en embriones tempranos.
Los animales transformados producidos de este modo tienen la capacidad de transmitir el gen transformado a las generaciones siguientes.
Teoría del bloqueo de genes o gene knockout
La recombinación se define como la ingeniería genética mediada por la recombinación homóloga in vivo. La recombinación se realiza con la ayuda de un bacteriófago. Los bacteriófagos como λ Red, RecET o sistemas similares son los más utilizados. La recombinación también puede utilizarse para deleciones, mutaciones puntuales, duplicaciones, inversiones, fusiones y etiquetas. Un sustrato de ADN lineal que contiene la modificación o las homologías deseadas se introduce en el ADN objetivo de las células. Las células expresan las enzimas recombinantes codificadas por el fago. Estas enzimas ayudan a incorporar el ADN lineal a la molécula objetivo. De este modo, se producen moléculas recombinantes. El sistema de recombinación más utilizado es el del bacteriófago λ Red. Este sistema está formado por las tres proteínas Gam, Exo Beta. La proteína Gam inhibe la exonucleasa RecBCD de E. coli, que normalmente degrada el dsDNA lineal. Gam no es esencial para la recombinación, pero aumenta la frecuencia de recombinación del dsDNA hasta 20 veces. Exo es una exonucleasa específica para el ADN de doble cadena 5’→3′ y es necesaria para la recombinación del ADNd. La proteína beta, una proteína anexa al ADN, es la recombinasa central para la recombinación.
Es importante señalar que las funciones de recombinación del huésped, incluida la proteína clave de recombinación RecA, no son necesarias para la recombinación.
