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Bloqueo de genes

Bloqueo de genes - crispr

Su trabajo ganador se basó en esta tecnología genética, que es el bloqueo de genes o también conocido como gene targeting en ratones. En 2007, los ganadores del Premio Nobel de Medicina fueron Mario R. Capecchi (EE.UU.), Sir Martin Evans (Reino Unido) y Oliver Smithies (EE.UU.). En el siguiente artículo descubriremos en qué consiste esta innovación de la ingeniería genética.

¿Qué es el Bloqueo de genes?

El término “knock-out” genético se refiere al uso de la ingeniería genética para desactivar o eliminar uno o más genes específicos de un organismo. También es posible eliminar dos genes de un organismo o incluso tres y cuatro. Este proceso se denomina doble knockout, triple knockout o cuádruple knockout. La abreviatura de este proceso es KO (de la palabra knock-out), doble DKO, triple TKO y cuádruple QKO. La tecnología se divide en knockout heterocigótico y homocigótico. En el KO heterocigótico sólo se elimina una de las dos copias del gen y en el otro tipo se eliminan ambos genes.

Ratones knockout

Los ratones de laboratorio son objeto de investigación en la tecnología knockout. Tanto los humanos como los ratones comparten muchos genes comunes, lo que los convierte en una especie adecuada para experimentos de este tipo. Cuando se realiza la prueba, podemos observar un resultado similar al que se produciría en un humano. Observar ratones knockout nos permite entender cómo un gen similar puede causar o contribuir a una enfermedad en humanos. Los ratones knockout han contribuido a la investigación de la diabetes, diversos tipos de cáncer, cardiopatías, artritis, abuso de sustancias, ansiedad, envejecimiento y enfermedad de Parkinson.

Importancia de esta tecnología

El Bloqueo de genes se utiliza principalmente para comprender el papel de un gen o una región específica del ADN comparando un individuo knockout con otro de vida libre con un fondo genético similar. Los organismos knockout también se utilizan como herramientas de cribado en el desarrollo de fármacos para atacar procesos biológicos específicos o comprender el mecanismo de acción de un fármaco.

El knock-in es el reverso del knock-out

En ingeniería genética, este proceso implica la inserción o sustitución de un gen por otro que normalmente no está presente en el organismo diana. Mediante este proceso, podemos obtener un organismo modelo para estudiar aspectos de una enfermedad específica.

Que es el bloqueo de genes

Sources :

  1. Genome
  2. Gentaur

Bloqueo de genes (gene knockout)

Bloqueo de genes (gene knockout)

El bloqueo de genes (gene knockout), o también llamado inactivación de genes , es una técnica genética en la que se suprime la expresión de un gen concreto en un organismo sustituyendo el gen original en su locus genético por una versión modificada del gen en la que se han eliminado uno o más exones, lo que da lugar a organismos que no expresan el gen en un tejido concreto o en todo el organismo. Estos organismos también se denominan knockout.

Un knockout es idéntico al anterior, pero en lugar de eliminar un gen concreto, lo sustituye por una versión alterada del mismo que produce una función adicional.

Bloqueo de genes o gene knockout

Las tecnologías de bloqueo de genes se utilizan para alterar los genomas de todos los organismos vivos. Cuando una mutación inactiva la función de un gen, se denomina gene knockout. Los métodos de knockout de genes se utilizan para identificar la función de un gen concreto inhibiendo la función de ese gen.

Este proceso se utiliza tanto en la genética clásica como en técnicas modernas como la genómica funcional. Inicialmente, la eliminación de genes se realizó mediante mutagénesis de transposones. La principal desventaja de este método es el tedioso cribado para encontrar el gen neutralizado. La eliminación de otros organismos se logró con la ayuda de la ingeniería genética.

Las técnicas in vitro se utilizan para modificar genes en plásmidos o cromosomas artificiales bacterianos (BAC), y estas construcciones modificadas se transfieren después al organismo en cuestión mediante técnicas de cultivo celular. Otros métodos utilizan una combinación de ingeniería genética y recombinación homóloga in vivo. Sin embargo, esta combinación no es tan eficaz.

La recombinación homóloga es la última herramienta para producir knockouts de genes. Permite la declaración directa del cromosoma bacteriano o la modificación de cualquier plásmido o BAC in vivo como precursores. Esta técnica no depende de los sitios de restricción. Un casete de fármaco puede colocarse en cualquier lugar de un gen o la lectura abierta del gen puede ser sustituida por el casete de fármaco. En cualquier caso, se selecciona la construcción deseada.

Métodos del bloqueo de genes (gene knockout)

Existen diferentes técnicas de biología molecular para influir en la expresión de los genes. Estas técnicas difieren en los instrumentos utilizados, el tiempo necesario para obtener un resultado positivo y la especificidad del resultado. Estas técnicas incluyen:

  • Recombinación homóloga: el gen original es sustituido por una versión mutada. Esta versión mutada puede eliminar casi toda la secuencia del gen o dejar la expresión de los primeros exones. Normalmente se tardan varios meses en obtener individuos modificados (especialmente en ratones), aunque tienen la ventaja de ser muy específicos: estos organismos sólo carecen del gen objetivo.
  • La transgénesis, que consiste en introducir en el gen original secuencias que lo modifican para producir cambios que dan lugar a proteínas no funcionales. Se trata de una técnica generalmente más rápida, cuyo inconveniente es que el gen endógeno sigue presente y puede producir una proteína, incluso mutada, que puede afectar a otras moléculas de la vía metabólica a la que pertenece. Además, puede producirse una nueva mutación por azar y revertir la modificación introducida produciendo de nuevo la proteína original, lo que ocurre con cierta frecuencia.
  • Mutagénesis. Los mutantes pueden obtenerse utilizando un producto mutagénico (por ejemplo, EMS) que produce mutaciones al azar. A continuación, se seleccionan los organismos que llevan codones “STOP” en la secuencia deseada. Se trata de un método rápido para obtener mutantes, aunque no es específico para el gen objetivo, lo que puede dar lugar a contratiempos.
  • Derribo. Las secuencias de ADN que expresan moléculas de ARN interferente pueden introducirse en el genoma de un organismo o directamente en las células. Estas moléculas interfieren específicamente en la expresión del gen diana, lo que suele dar lugar a una reducción de la expresión (por esta razón también se denominan “knockdown”). Esta técnica es más rápida que la obtención de un organismo “knock-out”, pero no da lugar a la eliminación completa de la expresión, y la secuencia introducida que codifica el ARN interferente también puede sufrir mutaciones que inactiven el efecto deseado.

Tecnologías para el knock-out genético

El mejor enfoque para producir un knockout genético es la recombinación homóloga. Mediante los métodos de knockout genético, se elimina un solo gen sin afectar a todos los demás genes de un organismo. Con este método, el organismo en el que el gen en cuestión deja de ser funcional se denomina organismo knockout. Cuando se elimina más de un gen en un organismo, se denomina doble knock-out o DKO, triple knock-out o TKO y cuádruple knock-out o QKO, dependiendo del número de genes.

Métodos de ingeniería genética

La eliminación de genes se lleva a cabo con elementos como plásmidos, construcciones de ADN o cromosomas bacterianos artificiales.
El proceso de knock-out del gen suele producir animales transgénicos en los que el gen objetivo ha sido alterado. Para crear animales transgénicos, se modifican genéticamente las células madre embrionarias o células ES y en el siguiente paso las células ES transformadas se insertan en embriones tempranos.

Los animales transformados producidos de este modo tienen la capacidad de transmitir el gen transformado a las generaciones siguientes.

Teoría del bloqueo de genes o gene knockout

La recombinación se define como la ingeniería genética mediada por la recombinación homóloga in vivo. La recombinación se realiza con la ayuda de un bacteriófago. Los bacteriófagos como λ Red, RecET o sistemas similares son los más utilizados. La recombinación también puede utilizarse para deleciones, mutaciones puntuales, duplicaciones, inversiones, fusiones y etiquetas. Un sustrato de ADN lineal que contiene la modificación o las homologías deseadas se introduce en el ADN objetivo de las células. Las células expresan las enzimas recombinantes codificadas por el fago. Estas enzimas ayudan a incorporar el ADN lineal a la molécula objetivo. De este modo, se producen moléculas recombinantes. El sistema de recombinación más utilizado es el del bacteriófago λ Red. Este sistema está formado por las tres proteínas Gam, Exo Beta. La proteína Gam inhibe la exonucleasa RecBCD de E. coli, que normalmente degrada el dsDNA lineal. Gam no es esencial para la recombinación, pero aumenta la frecuencia de recombinación del dsDNA hasta 20 veces. Exo es una exonucleasa específica para el ADN de doble cadena 5’→3′ y es necesaria para la recombinación del ADNd. La proteína beta, una proteína anexa al ADN, es la recombinasa central para la recombinación.

Es importante señalar que las funciones de recombinación del huésped, incluida la proteína clave de recombinación RecA, no son necesarias para la recombinación.

Fuentes

  1. Gene Method
  2. A high-throughput gene knockout procedure for Neurospora reveals functions for multiple transcription factors
  3. CRISPR

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