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western blotting Western blot

Western blot (Inmunoblot) : Electroforesis en gel para proteínas 2022

Electroforesis en gel para proteínas

El Western blot (inmunoblot) o electrotransferencia, es una técnica analítica usada en biología celular y molecular para identificar proteínas específicas en una mezcla compleja de proteínas, tal como la que se presenta en extractos celulares o de tejidos. La técnica utiliza tres etapas para lograr esto: separación por tamaño, transferencia a un soporte sólido y, finalmente, visualización mediante la marcación de proteínas con el uso de anticuerpos primarios o secundarios apropiados.

Western blot ¿Qué detecta?

El Western blot es una técnica de laboratorio utilizada para detectar una proteína específica en una muestra de sangre o de tejido. Este método implica el uso de la electroforesis en gel para separar las proteínas de la muestra. Las proteínas separadas se transfieren del gel a la superficie de una membrana. La membrana se expone a un anticuerpo específico contra la proteína estudiada. La unión del anticuerpo se detecta mediante una etiqueta radioactiva o química. A veces se utiliza un Western blot para diagnosticar una enfermedad.

Western blot (Inmunoblot) :Electroforesis en gel para proteínas

Western blotting o Western blot (también llamado inmunoblotting) es una técnica utilizada para el análisis de proteínas individuales en una mezcla de proteínas (por ejemplo, un lisado celular).

En el Western blot (inmunoblotting), la mezcla de proteínas se aplica mediante electroforesis en gel sobre una matriz de soporte (SDS-PAGE, PAGE nativa, enfoque isoeléctrico, electroforesis en gel 2D, etc.) para clasificar las proteínas según su tamaño, carga u otras diferencias en las bandas de proteínas individuales.

A continuación, las bandas de proteínas separadas se transfieren a una membrana de soporte (por ejemplo, nitrocelulosa, nylon o PVDF). Este proceso se llama “blotting”. Las proteínas se adhieren a la membrana en el mismo patrón en el que fueron separadas debido a las interacciones de carga.

Las proteínas de este inmunoblot son entonces accesibles a la unión de anticuerpos para su detección.

Los anticuerpos se utilizan para detectar las proteínas objetivo en los western blots (inmunoblots). Los anticuerpos se conjugan con etiquetas fluorescentes o radiactivas o con enzimas, que provocan una reacción posterior con un reactivo aplicado, dando lugar a una tinción o a una emisión de luz que permite la detección.

El término Western blotting se basa en un juego de palabras. El southern blot, que es un método para detectar secuencias específicas de ADN, lleva el nombre de Ed Southern, quien describió por primera vez el procedimiento.

Western blot (inmunoblot), así como northern blot (para la detección de ARN), juegan con el significado de este nombre.

western blot

¿Qué es la electroforesis en gel para proteínas?

La electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar fragmentos de ADN (u otras macromoléculas, como el ARN y las proteínas) según su tamaño y carga. La electroforesis consiste en aplicar una corriente a través de un gel que contiene las moléculas de interés. Dependiendo de su tamaño y carga, las moléculas se moverán a través del gel en diferentes direcciones o a diferentes velocidades, separándolas unas de otras.

  • La electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar fragmentos de ADN según su tamaño.
  • Las muestras de ADN se cargan en los pozos (ranuras) de un extremo del gel y se aplica una corriente eléctrica para arrastrarlas a través del gel.
  • Los fragmentos están cargados negativamente, por lo que se desplazan hacia el electrodo positivo. Dado que todos los fragmentos de ADN tienen la misma cantidad de carga por masa, los fragmentos más pequeños se mueven a través del gel más rápidamente que los fragmentos más grandes.
  • Cuando se tiñe un gel con un pigmento que se une al ADN, los fragmentos de ADN pueden verse como bandas, que representan un grupo de fragmentos de ADN del mismo tamaño.

Diferentes tipos de electroforesis en gel para proteínas

Se puede elegir entre diferentes tipos de electroforesis en gel para las proteínas en función de los criterios por los que se deben separar las proteínas. Algunos métodos electroforéticos comúnmente utilizados son: SDS-PAGE, native-PAGE y enfoque isoeléctrico.

SDS-PAGE:

Se trata de un método desnaturalizante, ya que trata las proteínas con un detergente aniónico SDS (dodilsulfato de sodio). La estructura secundaria y terciaria se destruye con este proceso. Además, el SDS se adhiere a las proteínas y, por tanto, cubre sus cargas químicas, lo que hace que las proteínas tengan una carga igualmente negativa.

Por tanto, la siguiente separación se produce únicamente por el tamaño de las cadenas polipeptídicas en el gel de poliacrilamida.

Native PAGE:

Con este método se pueden separar proteínas nativas, no plegadas y no desnaturalizadas. Este método permite la separación de proteínas que son inaccesibles por otros métodos. Un ejemplo sería la separación de proteínas modificadas y no modificadas del mismo tipo (por ejemplo, el estado fosforilado frente al no fosforilado de una proteína). La PAGE nativa también puede utilizarse para confirmar conformaciones biológicamente relevantes, como las formas di-, tri- o tetraméricas de las proteínas (al contrario que la SDS-PAGE, que separaría las cadenas peptídicas individuales y desnaturalizadas). Este método también puede detectar diferentes complejos de distintas proteínas.

La separación mediante “Nativo PAGE” depende de una serie de parámetros como la carga, el tamaño y la estructura 3D de la proteína. Se necesita un tampón adecuado para mantener el plegado 3D de la proteína. La aplicabilidad del tampón depende del punto isoeléctrico y de las cargas de la proteína.

Enfoque isoeléctrico:

Este método se basa en el hecho de que una proteína tiene una carga específica a determinados valores de pH. Dependiendo del pH, los grupos funcionales ácidos y básicos contribuyen a aumentar o disminuir la carga total de la proteína. El punto isoeléctrico se define como el punto en el que la carga total de la molécula es cero, porque hay una cantidad igual de carga negativa y positiva en la molécula.

Para el enfoque isoeléctrico se necesitan geles de gradiente especiales, ya que el pH cambia de ácido a básico a lo largo de un gradiente en el gel. Debido a una carga eléctrica unida al gel, la proteína se desplaza al punto del gel donde la carga del gel es igual a la carga de la proteína, y la carga total es cero, es decir, el punto isoeléctrico. Este método se utiliza entonces para separar las proteínas según sus cargas, así como para determinar el punto isoeléctrico de una proteína objetivo. La separación se basa en la carga de la proteína o en el número de grupos básicos y ácidos de la misma.

Los métodos anteriores para la electroforesis en gel de proteínas también pueden combinarse para separar las proteínas. La elección de los métodos depende de los requisitos específicos del experimento.

Blotting

Tras la separación de la mezcla de proteínas, las bandas de polipéptidos se transfieren a un soporte de membrana. Para ello, la membrana se adhiere al gel y este llamado sándwich se transfiere a una cámara de electroforesis. Es posible que una parte del SDS se elimine y que la proteína vuelva a saturarse parcialmente, es decir, que recupere su estructura 2D y 3D. Sin embargo, la carga eléctrica aplicada hace que las proteínas se desplacen fuera del gel verticalmente en la dirección en la que se desplazaron en el gel, sobre la membrana. De este modo, las bandas de proteínas se unen a la membrana. Las bandas “borradas” están ahora disponibles para ser tratadas posteriormente (por ejemplo, para la detección de proteínas específicas con anticuerpos específicos).

Inmunodetección

La identificación de anticuerpos específicos es posible tras la separación y el “blotting” de las proteínas. Los anticuerpos específicos (monoclonales o policlonales) se unen a “su” banda de proteínas. Los anticuerpos de unión inespecífica se eliminan mediante el lavado con tampones que contienen detergentes. Además, las bolsas de unión inespecífica pueden bloquearse antes de añadir los anticuerpos específicos.

Por lo general, se aplican primero los anticuerpos primarios, que luego son reconocidos por un anticuerpo secundario. El anticuerpo secundario se conjuga con color, radiactividad o una enzima para su detección. También se utilizan anticuerpos conjugados con biotina para este fin.

¿Por qué es importante el Western Blot (Inmunoblot)?

Western blotting o Western blot (inmunoblotting) tiene varias ventajas sobre otros ensayos de inmunoabsorción (ISA) como el ELISA.

El Western blot (inmunoblotting) amplía la idea del ELISA al permitir la separación de la mezcla de proteínas por tamaño, carga y/o conformación. El método de stripping descrito permite la detección de varias dianas, a diferencia del método ELISA, en el que sólo se puede detectar una proteína.

Como la electroforesis en gel de proteínas separa las proteínas en bandas, es posible determinar el tamaño de la proteína/péptido objetivo. También es posible (semi)cuantificar la proteína de interés ejecutando una cantidad de estándar interno en paralelo con las muestras en el gel.

Además, se puede comparar el contenido en proteínas de las muestras (“la muestra A contiene más proteínas que la muestra B”).

La desventaja del western blot (inmunoblot) es que lleva mucho tiempo (en comparación con el ELISA) y requiere una gran experiencia por parte del investigador.

También requiere la optimización de las condiciones experimentales (es decir, el aislamiento de las proteínas, los tampones, el tipo de separación, la concentración del gel, etc.).

Hay muchos tipos y métodos diferentes de western blotting (inmunoblotting). Por lo tanto, abarca temas y aplicaciones muy diferentes.

Podéis leer mucho más en nuestro blog 

Mouse IFN beta ELISA

Las características del “Mouse IFN-beta ELISA”

  • Los emparejamientos optimizados de anticuerpos de captura y detección con las concentraciones recomendadas ahorran mucho tiempo de desarrollo
  • Se proporcionan protocolos de desarrollo para guiar la optimización del ensayo
  • El ensayo puede adaptarse a sus necesidades específicas
  • Alternativa económica a los kits completos
SOCS-1 Antibody

SOCS1 es un miembro de la familia de los inhibidores de STAT (SSI), también conocidos como supresores de la señalización de citoquinas (SOCS). Los miembros de la familia SSI son reguladores negativos de la señalización de citoquinas. SOCS1 funciona a la salida de los receptores de citoquinas y participa en un bucle de retroalimentación negativa para atenuar la señalización de las citoquinas.

Los anticuerpos policlonales se producen inmunizando a los animales con un péptido sintético correspondiente a los residuos que rodean a Ala156 de SOCS1 humana. Los anticuerpos se purificaron mediante cromatografía de afinidad de proteínas A y péptidos.

Anti-SLC1A5 Antibody

Varios proveedores ofrecen antibodies anti-SLC1A5. Este gen codifica la proteína “solute carrier family 1 member 5” en humanos y también puede ser conocido como ASCT2, AAAT, ATBO, M7V1, neutral amino acid transporter B(0), y ATB(0). Estructuralmente, la proteína tiene una masa de 56,6 kilodaltons. Basándose en el nombre del gen, también se pueden encontrar ortólogos caninos, porcinos, de mono, de ratón y de rata.

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