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Northern blot para que sirve

Northern blot para que sirve

La técnica de Northern blot es una técnica utilizada para estudiar la expresión de los genes. Se realiza mediante la detección de un ARN específico (o ARNm aislado). El ARNm suele estar representado en un 5% de la secuencia total de ARN. Este método revela la identidad, el número, la actividad y el tamaño del gen concreto.

Técnica Northern Blotting

Esta técnica de blotting también puede utilizarse para el crecimiento de un tejido u organismo. En las diferentes etapas de diferenciación y morfogénesis, la abundancia de un ARN cambia, lo que puede ser identificado por esta técnica. También puede identificar estados anormales, enfermos o infectados a nivel molecular. La técnica del northern blot fue desarrollada en 1977 por James Alwine, David Kemp y George Stank en la Universidad de Stanford. La técnica recibió su nombre por la similitud del proceso con el southern blot. La principal diferencia entre ambas técnicas es que en el norte sólo interviene el ARN en la tinción.

Los subtipos de blot, como el norte, el oeste y el sur, dependen de la molécula objetivo que se busque. Cuando una secuencia de ADN es la base o el código de una molécula de proteína, la molécula de ADN concreta de interés puede marcarse mediante Southern Blotting. En la expresión génica, cuando el ADN se expresa como ARNm para la producción de una proteína, este proceso puede identificarse mediante Northern blotting. Por último, cuando el ARNm codificado produce la proteína de interés, esta identificación de la proteína puede realizarse mediante Western blotting.

Procedimiento general de secado:

  • Homogeneizar la muestra.
  • Separación de la molécula de interés mediante una membrana de electroforesis.
  • Transferencia de las moléculas a una membrana de nitrocelulosa/nylon.
  • Hibridación o identificación de la molécula.

La técnica Northern Blotting es usada para...

La técnica de Northern blot es una técnica analítica utilizada en biología y química para detectar ARN específicos a partir de una mezcla de ARN. La técnica fue desarrollada por James Alwine en 1971 en la Universidad de Stanford.

En esta técnica :

  • Los ARN se desnaturalizan rompiendo los enlaces H mediante la aplicación de formaldehído (no mediante la aplicación de una endonucleasa de restricción, como se hace en el Southern blotting).
  • A continuación, los ARN se inmovilizan en una membrana de nailon o nitrocelulosa tras su separación por electroforesis.
  • La detección se realiza mediante sondas marcadas radiactivamente, por ejemplo P-32, bajo un autorradiograma o sondas no radiactivas (bioluminiscentes o ligadas a enzimas).
Northern Blotting

Northern blotting steps

La técnica de Southern blot consta de cuatro pasos básicos:

En el primer paso, la muestra de ADN se divide o digiere en pequeños fragmentos utilizando una enzima de restricción. Tras la digestión, los fragmentos de ADN se separan mediante electroforesis en gel. Para ello se suele utilizar un gel de agarosa. La electroforesis muestra varias bandas que parecen un blot debido a la presencia de varios fragmentos de restricción pequeños en el gel. A continuación, se utiliza NaOH para desnaturalizar el ADN y convertirlo en cadenas simples.

A continuación, estas bandas se transfieren a la superficie de una membrana utilizando un gradiente eléctrico que suele ser una hoja de papel llamada papel secante. El patrón de los fragmentos de ADN en el gel sigue siendo el mismo tras la transferencia al papel secante.

A continuación, se introduce en el papel secante una sonda formada por fragmentos de ADN monocatenario. Las bases de la sonda de ADN se emparejarán con secuencias de ADN complementarias en el gel para formar el ADN de doble cadena. La sonda suele estar marcada con una etiqueta química o radiactiva para permitir el seguimiento de la sonda en el gel. Se utilizan sustratos químicos y películas de rayos X para localizar la sonda si la etiqueta es una enzima. Las etiquetas radiactivas pueden aparecer directamente en las películas de rayos X.

Principio

Como todas las técnicas normales de blotting, el Northern blotting comienza con la electroforesis para separar las muestras de ARN según su tamaño. La electroforesis separa las moléculas de ARN según la carga de los ácidos nucleicos. La carga de los ácidos nucleicos es proporcional al tamaño de la secuencia del ácido nucleico.

Así, la membrana de electroforesis separa la secuencia de ácidos nucleicos según el tamaño de la secuencia de ARN. En los casos en que nuestra secuencia objetivo es un ARNm, la muestra puede aislarse mediante técnicas de cromatografía de oligocelulosa, ya que los ARNm se caracterizan por la cola de poli(A). Como las moléculas de gel son frágiles por naturaleza, las secuencias separadas se transfieren a membranas de nailon. La elección de la membrana de nylon se debe a que los ácidos nucleicos están cargados negativamente por naturaleza. Una vez transferidas las moléculas de ARN, se inmovilizan mediante un enlace covalente. A continuación se añade la sonda, que puede ser complementaria a una secuencia de ssDNA. La formamida se utiliza generalmente como tampón de blotting, ya que reduce la temperatura de recocido.

northern blot Aplicaciones

Técnicas como la PCR en tiempo real permiten una detección muy fiable y rápida incluso de una pequeña secuencia de objetivos, mientras que el Southern blot requiere una gran cantidad de ADN objetivo. Además, las técnicas más recientes, como la hibridación fluorescente in situ (FISH), permiten una identificación muy sensible de secuencias de nucleótidos específicas en una muestra de tejido con una localización precisa. La PCR en tiempo real y la FISH también permiten una cuantificación precisa de la diana, algo que no puede lograrse completamente con Southern blot.

Southern blot tiene varias aplicaciones en el laboratorio de biología molecular actual. Algunas de las principales aplicaciones de Southern blot son

  • Identificación de un único gen en un conjunto de fragmentos de ADN
  • Mapeo genético
  • Análisis de los patrones genéticos del ADN
  • Detección de secuencias específicas de ADN en un genoma
  • el estudio de las supresiones, duplicaciones y mutaciones de genes que causan diversas enfermedades
  • detectar enfermedades genéticas y cánceres, como la leucemia monoclonal y las mutaciones de células falciformes
  • detectar la presencia de una familia de genes en un genoma
  • huellas genéticas y pruebas forenses, como las pruebas de paternidad y la determinación del sexo.

Western Blot

La técnica de Western blot determina el peso molecular de las proteínas y mide la abundancia de las mismas en diferentes muestras.

Características Western Blot :

  • Después de la separación por electroforesis en gel mediante el método SDS-PAGE, las proteínas se transfieren a un papel especial de secante llamado nitrocelulosa, aunque se pueden utilizar otros tipos de papel o membranas. Las proteínas conservan el mismo patrón de separación que tenían en el gel.
  • El blot se incuba con una proteína genérica (como una proteína de la leche) para que se una a cualquier punto pegajoso que quede en la nitrocelulosa. A continuación, se añade a la solución un anticuerpo capaz de unirse a su proteína específica. El anticuerpo se conjuga con fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano.
  • La posición del anticuerpo se revela incubando un sustrato incoloro que la enzima unida convierte en un producto coloreado que puede verse y fotografiarse.

El Western blot (a veces llamado inmunoblot de proteínas) es una técnica analítica ampliamente reconocida que se utiliza para detectar proteínas específicas en una determinada muestra homogeneizada o extracto de tejido. Las muestras de Western blot pueden tomarse de tejidos enteros o de cultivos celulares. Los tejidos sólidos se trituran primero mecánicamente mediante una batidora (para volúmenes de muestra grandes), un homogeneizador (para volúmenes pequeños) o por sonicación. Pueden utilizarse detergentes, sales y diversos tampones para estimular la lisis celular y solubilizar las proteínas.

Está técnica usa electroforesis en gel para separar las proteínas nativas según su estructura tridimensional o las proteínas desnaturalizadas según la longitud del polipéptido.

Western Blot

Western Blot protocolo

El Western Blot (WB) es una técnica de uso común en la biología molecular y celular, así como en la ingeniería de proteínas. Mediante un ensayo de WB, los investigadores pueden separar e identificar proteínas específicas a partir de una mezcla compleja de extracciones de proteínas en las células. Esta tarea consta de tres partes principales: la separación por tamaño molecular, la transferencia a un soporte sólido mediante electroforesis en gel y la incubación de la proteína objetivo con etiquetas de anticuerpos primarios y secundarios adecuados para su visualización.

WESTERN BLOTTING PASOS:

  1. Preparación de la muestra: lisis celular y extracción de proteínas Electroforesis en gel SDS-PAGE
  2. Transferencia de la membrana
    a) Transferencia desde el depósito
    b) Transferencia semiseca
  3. Inmunodetección
    a) Protección tradicional del inmunoensayo
    b) Protocolo de inmunodetección de 30 minutos con SNAP i.d.
    c) Inmunodetección de la marcha con Immobilon GO
Western Blot protocolo

En el pasado se han desarrollado y revisado muchas técnicas de ensayo de anticuerpos, como la inmunofluorescencia indirecta (IIF) y el ensayo inmunoenzimático (ELISA). Aunque son sensibles, estos métodos también están sujetos a reacciones cruzadas que hacen que los resultados positivos débiles sean difíciles de interpretar.

Diferencia entre Southern Northern y Western Blotting

La principal diferencia entre la tinción sur-norte y la tinción oeste es que la tinción sur implica la identificación del ADN, y la tinción norte implica la identificación del ARN, mientras que la tinción oeste implica la identificación de las proteínas.

La tinción sur, norte y oeste son tres técnicas de blotting utilizadas para detectar una molécula específica de ADN, ARN o proteína en una muestra. Durante el blotting, las macromoléculas se transfieren del gel a una membrana y se unen a un ácido nucleico o anticuerpo específico que facilita la detección.

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