CRISPR | Gentaur
El acrónimo CRISPR designa secuencias repetitivas en el ADN de las bacterias, que funcionan como autovacunas.
Muchas enfermedades humanas son de naturaleza genética, causadas por cambios o mutaciones en la secuencia genética de un individuo o por la expresión aberrante de ciertos genes. La terapia génica tiene como objetivo corregir o sustituir el gen disfuncional de una célula, y el primer ensayo clínico realizado con éxito en 1990 dio a muchos pacientes la esperanza de un posible tratamiento cuando las opciones anteriores eran limitadas o inexistentes.1 Pero la terapia génica sufrió algunos contratiempos importantes: una reacción inmunitaria al sistema de administración viral provocó la muerte de un paciente en un ensayo clínico y varios pacientes desarrollaron leucemia debido a la inserción de un gen en un locus oncogénico. Estos trágicos sucesos suscitaron importantes problemas de seguridad y los ensayos clínicos de terapia génica se detuvieron durante más de una década.
¿Qué es CRISPR?
CRISPR es una tecnología que puede utilizarse para modificar genes y, como tal, tiene el potencial de cambiar el mundo.
La esencia de CRISPR es sencilla: es una forma de encontrar un trozo específico de ADN en una célula. El siguiente paso en la edición de genes CRISPR suele ser editar ese trozo de ADN. Sin embargo, CRISPR también se ha adaptado para hacer otras cosas, como activar o desactivar genes sin cambiar su secuencia.
¿Qué es CRISPR-Cas9?
CRISPR-Cas9 es una herramienta de edición del genoma que está arrasando en el mundo científico. Es más rápida, más barata y más precisa que las anteriores técnicas de edición del ADN y tiene una amplia gama de aplicaciones potenciales.
CRISPR-Cas9 es una tecnología única que permite a los genetistas e investigadores médicos modificar partes del genoma eliminando, añadiendo o alterando secciones de la secuencia de ADN.
Actualmente es el método más sencillo, versátil y preciso de manipulación genética, por lo que está despertando un gran interés en el mundo científico.
Terapia celular y génica con CRISPR
La terapia génica tiene como objetivo tratar enfermedades introduciendo material genético para corregir una mutación o proporcionar una copia funcional de un gen. Las modificaciones pueden ser in vivo, directamente dentro del cuerpo humano, o ex vivo, fuera del cuerpo. Otro enfoque es la terapia celular, que consiste en introducir células enteras en el paciente, utilizando células derivadas del propio paciente o de donantes sanos. En las aplicaciones de investigación, CRISPR-Cas9 ha superado a las anteriores tecnologías de edición de genes debido a su eficacia y simplicidad inherentes: en lugar de requerir una costosa y larga ingeniería de proteínas, los cambios en las secuencias genómicas pueden realizarse con una porción de 20 nucleótidos de un único ARN guía (sgRNA). Se está trabajando intensamente para llevar este mismo poder a las aplicaciones clínicas.
Limitaciones
Aunque CRISPR es un enfoque prometedor para la terapia celular y génica, tiene varias limitaciones, como la actividad fuera del objetivo y la edición ineficaz del daño del ADN, la entrega y la toxicidad, pero el rápido progreso de la tecnología CRISPR significa que ya se han desarrollado varias estrategias para sortearlas:
Modificación de Cas9 para reducir la actividad fuera del objetivo: una de las principales preocupaciones de CRISPR es la actividad fuera del objetivo, es decir, la introducción de una edición en un punto inesperado. Un enfoque para reducir la actividad fuera del objetivo es utilizar una Cas9 “nicasa” modificada que sólo puede introducir una sola línea de modificación con variantes nicasa, requiriendo así un par sgRNA compensatorio para introducir una doble línea de rotura, lo que disminuye la probabilidad de que esto ocurra en sitios fuera del objetivo.8 Alternativamente, la energía de unión al ADN de Cas9 puede ser alterada, creando variantes Cas9 de alta fidelidad como SpCas9-HF, SpCas9-NG, evoCas9 y Cas9_R63A/Q768A. Estas variantes de Cas9 diseñadas tienen una menor capacidad para modificar los sitios no coincidentes, lo que mejora significativamente la especificidad de la diana y mantiene la escisión de la misma.
Diseño óptimo de la guía: Hay varios elementos del sgRNA que pueden influir en la especificidad, como la secuencia semilla de 10-12 pb, el contenido de GC y los truncamientos en el extremo 5′, y no todos los sgRNA producen una edición eficiente y específica. Los científicos han desarrollado plataformas computacionales capaces de proporcionar secuencias guía optimizadas con respecto al gen de interés, como E-Crisp, CRISPR-Design y CasOFFinder, que utilizan algoritmos generados a partir de datos de cribado fenotípico. Más recientemente, sgDesigner empleó una biblioteca de plásmidos de silicio para generar datos de eficiencia de edición, en lugar de depender de los resultados variables del cribado fenotípico. La herramienta sgDesigner ha superado a las anteriores y promete ser una plataforma más sólida para el diseño de guías.
Mejora de la orientación con proteínas Cas alternativas: Cas9 de S. pyogenes es la proteína Cas9 más utilizada, que reconoce el sitio 3′-NGG’5′ Protospacer Adjacent Motif (PAM). Sin embargo, su gran tamaño dificulta su empaquetamiento en vectores AAV para la administración de terapia génica. Las alternativas de Cas9 más pequeñas, como S. aureus Cas9 (SaCas9), requieren un PAM más largo, lo que reduce el número de sitios objetivo disponibles para la terapia génica y celular. Las variantes Sp-Cas9-NG y xCas9 se diseñaron para ser más pequeñas con un gran requisito de PAM.12,13 Pero la nueva variante SpRY de Cas9 se desarrolló para reconocer NRN > NYN, por lo que prácticamente no tiene ningún requisito de PAM y ofrece la posibilidad de editar cualquier sitio del genoma.14 También se han desarrollado variantes de Cas9 dirigidas al ARN, como SpyCas9 y Cas13d, que pueden ofrecer la edición de genes sin introducir una doble rotura.
Reducción de la toxicidad del daño al ADN con editores de bases y núcleos: Las tasas de eficacia de la edición para la recombinación homóloga (HDR) son bajas, a menudo propensas a errores, y la introducción de una doble rotura en el ADN puede inducir la apoptosis de las células, lo que constituye un importante problema de seguridad para las aplicaciones clínicas. Un avance reciente ha sido el desarrollo de la tecnología de edición de bases, que utiliza una nicasa Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) unida a una deaminasa para facilitar la edición de un solo nucleótido sin inducir la toxicidad del daño al ADN . Más recientemente, se ha desarrollado la edición primaria, en la que una nicasa Cas9 se conjuga con una transcriptasa inversa -junto con un ARN guía de edición primaria (ARNp) que contiene la modificación requerida-, el sistema de edición primaria puede “buscar y reemplazar” las modificaciones deseadas, proporcionando así una edición genética de precisión con una actividad fuera del objetivo significativamente reducida.
TERAPIA CRISPR: evitar el cuello de botella del sgRNA GMP
Pero llevar CRISPR a la clínica es caro y requiere mucho tiempo: tratar la anemia de células falciformes cuesta hasta 2 millones de dólares por un solo paciente. En la fase de descubrimiento preclínico, los reactivos CRISPR utilizados serán sólo para fines de investigación (RUO). La disponibilidad, flexibilidad y accesibilidad de los sgRNAs para la investigación permite que ésta sea ágil y se mueva rápidamente para establecer la prueba de concepto de las terapias basadas en CRISPR. Pero la transición a la clínica requiere el desarrollo y la aplicación de reactivos de calidad GMP (Good Manufacturing Practice) para garantizar la trazabilidad, seguridad, pureza y eficacia de estos productos. La transición del ARNsg de la RUO a las GMP puede ser complicada y, sin una planificación adecuada, la transición del descubrimiento al desarrollo del proceso puede ir acompañada de importantes cuellos de botella. Una buena manera de garantizar una transición sin problemas es asegurarse de que los proveedores de reactivos CRISPR tengan la capacidad y la experiencia necesarias para producir reactivos de calidad GMP.
El futuro de las terapias CRISPR está aquí
Desde el artículo seminal de Doudna y Charpentier de hace más de una década, CRISPR ha revolucionado la edición de genes y ofrece interesantes posibilidades para la terapia celular y génica. CRISPR puede utilizarse para editar secuencias de ADN in vivo y ex vivo con el fin de tratar una serie de enfermedades genéticas, así como para modificar células para repararlas o mejorar su función, por ejemplo modificando las células T para aumentar su eficacia en la lucha contra el cáncer. Todavía existen limitaciones, pero el desarrollo exponencial de la tecnología está permitiendo soluciones de mitigación rápida, ofreciendo un tratamiento potencial para muchas enfermedades humanas.
Puntos clave a recordar
- Las tecnologías de edición de genes, como CRISPR-Cas9, son muy prometedoras para las aplicaciones clínicas porque las modificaciones genéticas pueden realizarse in situ, evitando la adición de material genético en sitios potencialmente no deseados del genoma.
- Las terapias basadas en CRISPR desempeñan un papel en varios estudios de terapia génica y celular actualmente en curso en diversas áreas terapéuticas.
- La tecnología CRISPR-Cas9 todavía tiene limitaciones, pero el rápido progreso de la tecnología CRISPR significa que ya se están desarrollando varias soluciones de mitigación, incluyendo proteínas Cas9 modificadas para reducir la actividad fuera del objetivo, herramientas de diseño para seleccionar sgRNAs óptimos, y editores nucleares y primarios para reducir la toxicidad del daño al ADN.
- La introducción de CRISPR en la clínica requiere pasar de los reactivos destinados a la investigación (RUO) a los reactivos de calidad GMP (buenas prácticas de fabricación), lo que puede resultar complicado. Pero la colaboración con proveedores establecidos y experimentados puede facilitar la transición.